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2024-01-02 20:05

超小PtMn纳米颗粒作为敏感的锰释放调节剂用于特异性癌症治疗


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摘要。

锰基纳米材料在癌症诊断和治疗方面具有巨大的潜力。然而,大多数mn -纳米材料对肿瘤微环境的轻度弱酸性(pH 6.4-6.8)的敏感性和效率较低,导致治疗效果不理想,磁共振成像(MRI)性能较差。本研究介绍了ph超敏感的PtMn纳米颗粒作为一个新的平台,以增强铁中毒为基础的癌症治疗。合成了直径在5.3 ~ 2.7 nm之间的PtMn纳米颗粒,具有尺寸优势的催化活性和磁弛豫,并用酸响应聚合物修饰以制备ph敏感剂。重要的是,与R-PtMn-2 (4.2 nm核心,3.7倍)或R-PtMn-3 (5.3 nm核心,2.1倍)相比,R-PtMn-1 (3 nm核心)具有“开启”氧化酶样活性,催化活性显著增强(pH 6.0/pH 7.4)(6.7倍)。此外,R-PtMn-1在高场MRI中表现出双模对比。R-PtMn-1具有良好的增强比(pH 6.4/pH 7.4), T1-或T2-MRI分别为3或3.2倍,高于R-PtMn-2(1.4或1.5倍)或R-PtMn-3(1.1或1.2倍)。此外,它们的ph超敏感性能够在肿瘤微环境中特异性激活,避免在分娩过程中对正常组织产生脱靶毒性。体外研究表明,细胞内活性氧生成、脂质过氧化、线粒体膜电位变化、丙二醛含量和谷胱甘肽耗竭升高,导致癌细胞铁下垂增强。同时,正常细胞不受纳米颗粒的影响。总之,ph超敏感的PtMn纳米颗粒为准确的癌症诊断和基于铁中毒的治疗提供了一个有希望的策略。

图形抽象

介绍

锰基纳米材料(mn -纳米材料)为纳米医学在癌症诊断和治疗中的广泛应用提供了一个通用的平台[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13]。一方面,锰纳米材料如MnO、MnO2、PtFe@MnO等已被开发为用于生物医学成像的磁共振成像(MRI)造影剂[1,2,3,4,5,6]。它们具有5个未配对电子、强顺磁性、长电子弛豫时间和Mn2+离子不稳定的水交换,可用于肿瘤诊断、Ca2+活性检测和肿瘤进展监测[1,2,3,14,15]。另一方面,锰(Mn)作为人体必需微量元素,以多种氧化态(+ 2、+ 3、+ 4)存在,参与电子转移反应、分子氧活化、储存、转运等重要的生物过程[1,14]。锰纳米材料由于具有可变的锰态和形态,表现出与过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)相似的内在活性[16,17,18]。通过mn介导的Fenton反应、高效谷胱甘肽(GSH)耗竭和氧(O2)生成,mn纳米材料可用于各种治疗,包括光动力治疗、光热治疗、磁热疗法、化学动力治疗、声动力治疗、放疗、化疗、基因治疗、饥饿治疗、铁沉、免疫治疗和联合治疗[12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,34,35]。然而,它们在产生活性氧(ROS)方面的“非选择性”催化作用往往导致正常组织在递送过程中出现明显的“脱靶”毒性。

与健康组织(pH 7.4)相比,肿瘤微环境(pH 6.4-6.8)呈酸性,因此研究人员开发了几种酸激活的铁下垂剂[36,37,38,39,40,41,42,43]。然而,大多数pH触发的铁下垂剂对肿瘤中相对较弱的酸度不敏感,导致催化活性增强比(pH 6.4/pH 7.4)效率低下[18,43,44]。典型的Fenton/Fenton-like反应需要足够的酸度(pH 3.0-6.0)和丰富的过氧化氢(H2O2)才能保证较高的催化反应速率[18,43,45]。然而,肿瘤发生过程中糖酵解代谢上调导致的轻度酸性环境(pH 6.4-6.8)不利于触发Fenton/Fenton样反应[46,47,48,49]。因此,依赖于这些不良反应的治疗效果受到很大限制[50,51,52]。此外,瘤内H2O2浓度(通常为50-100 μM)不足以维持活性氧的持续生成,导致脂质过氧化不足。因此,迫切需要开发不依赖H2O2的pH超敏感活化铁下垂策略(pH 6.4-6.8)。

为了解决这些问题,我们通过调整1-十八烯/二苄基醚的体积比(方案1),设计了一系列直径(分别为2.7±0.6、4.2±0.7和5.3±0.6 nm)大小一致的PtMn纳米颗粒(PtMn-1、PtMn-2和PtMn-3)。我们进一步用酸响应聚合物修饰这些PtMn纳米颗粒,制备了ph敏感剂(R-PtMn-1、R-PtMn-2和R-PtMn-3)。有趣的是,我们发现R-PtMn-1表现出更高的氧化酶样催化活性增强比(pH 6.0/pH 7.4)(6.7倍),与大尺寸的纳米颗粒(R-PtMn-2, 3.7倍或R-PtMn-3, 2.1倍)相比。高增强率允许ROS和脂质过氧化的有效产生,从而提高癌症治疗的治疗效果。此外,R-PtMn-1也表现出明显的增强对比度(pH 6.4/pH 7.4),在t1磁共振成像(MRI)上是3倍,在t2磁共振成像(MRI)上是3.2倍。相比之下,R-PtMn-2和R-PtMn-3在T1-MRI上的增强对比分别为1.4倍和1.1倍,而在T2-MRI上的增强对比分别为1.5倍和1.2倍。MRI成像的高增强对比度有助于提高信噪比,突出相关的生物现象。因此,超小的R-PtMn-1纳米颗粒(核心小于3 nm)在不需要H2O2的情况下表现出ph超敏感的MRI成像和催化增强。

方案1
scheme 1

5.3 ~ 2.7 nm的均匀小PtMn纳米合金的工程尺寸合成示意图,具有较高的类氧化酶活性增强率和磁共振成像对比度。超小PtMn-1纳米平台可作为ph超敏感的铁下垂剂用于高场磁共振成像和高效的癌症治疗

值得注意的是,R-PtMn-1的pH超敏感氧化酶样催化作用在肿瘤微环境(细胞外pH 6.4-6.8)中被特异性激活。此外,R-PtMn-1在肿瘤中表现出ph超敏感的T1-/ t2高场(7t) MRI信号,这些信号足够敏感,可以有效激活信号。相反,R-PtMn-1在正常组织中没有可检测到的氧化酶活性和微弱的成像信号,从而减少了健康组织中的脱靶毒性和假信号。我们开发的ph超敏感高场mri综合治疗剂允许通过T1-/T2-MRI信号变化进行准确成像和基于铁中毒的治疗。

材料与方法

PtMn纳米颗粒的合成

通常,Pt(acac)2 (40 mg)混合到1-十八烯(ODE)和二苯醚(DE) (12 mL)的溶液中,在100 mL斜三颈球烧瓶中。将透明混合液强烈搅拌(超过300 rpm/min),在高纯度氩气(99.99%)下90℃保存1 h以上。然后快速加入Mn(acac)2 (22.5 mg), OA和OLA用量为0.7 mmol。将黑色溶液在300℃回流2 h以上,自然冷却至室温,高速离心(11000 rpm/min, 20 min),等量洗涤多余的乙醇和丙酮3次。离心后,将纳米颗粒分散在3ml四氢呋喃中进一步表征。不同尺寸的PtMn纳米颗粒(PtMn-1, PtMn-2, PtMn-3)的制备方法相同,但分别使用不同体积比的ODE和DE(1:0, 1:1, 0:1)。

聚合物的合成

PEG-RAFT,即ph响应性聚合物或非ph响应性聚合物,是根据之前的报道[53,54]制备的。采用可逆加成-破碎链转移(RAFT)聚合策略制备了ph响应聚合物。PEG-RAFT (30 mg), DPA (154 mg), AIBN (0.15 mg)溶解于3ml二氧六环中,加入烧瓶中。将烧瓶密封在干氩气下,在70℃下保存2天以上。反应结束后,用超纯水对溶液进行水解(MWCO: 3.5 KDa)。最后,将溶液冻干,得到ph响应聚合物。

figure b

对于非ph响应聚合物的合成,在烧瓶中加入二氧六环的DPA取代MM (72 mg)。其他程序类似于制备ph响应聚合物的程序。

figure c

样品用于MALDI-TOF和GPC表征

2 mg ph响应聚合物分散在1 mL四氢呋喃中,用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。凝胶渗透色谱(GPC)采用ph响应聚合物20 mg。相对分子量测定的流动相为四氢呋喃。

聚合物包覆PtMn的制备

将50 μg不同粒径的PtMn纳米粒子(PtMn-1、PtMn-2、PtMn-3)和2 mg ph响应聚合物溶于1 mL四氢呋喃(THF)中,制备ph响应聚合物包被PtMn。将溶液超声约20分钟后迅速加入4ml超纯水中,再超声20分钟。随后,蒸发四氢呋喃,得到聚合物包被的PtMn溶液(R-PtMn-1、R-PtMn-2或R-PtMn-3)。所得溶液用离心滤管用水洗涤3次以上。

对于非ph响应性聚合物包被PtMn-1纳米颗粒的制备,除了使用2 mg非ph响应性聚合物外,主要步骤与制备响应性聚合物包被PtMn纳米颗粒相似。

样品用于XPS表征

在HEPES缓冲液(10 ×, 5.4)中加入0.1 mL PtMn-1四氢呋喃(2 mg/mL),室温作用1 h,离心后分散于0.1 mL四氢呋喃中。将溶液滴在硅片上,并在室温下干燥,以进一步进行XPS表征。

自我测量从PtMn释放的tal离子

取R-PtMn-1或Nr-PtMn-1 (0.1 mL, Mn: 0.75 mg/mL)分别于900 μL HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐水)中与不同缓冲液(2 ×, pH = 4.4、5.4、6.4、7.4)在37℃下孵育不同时间点。然后用离心滤管(3kda)过滤混合溶液,收集滤液的等分物,通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定Pt和Mn的浓度。

DLS和zeta电位的测量

R-PtMn-1 (Mn: 5 μg/mL)在0.1 mL HEPES缓冲液中与不同缓冲液(2倍,pH = 4.4、5.4、6.4、7.4)孵育12 h, R-PtMn-1、R-PtMn-2、R-PtMn-3 (Mn: 0.1 μg/mL)分别在H2O、DPBS、HEPES、DMEM中分散12、24、48 h。然后将上述溶液稀释(1/40),测定DLS。取0.1 mL Nr-PtMn-1或R-PtMn-1 (Mn: 5 μg/mL)与0.1 mL HEPES缓冲液(2倍,pH = 4.4, 5.4, 6.4, 7.4)孵育6 h,然后将上述溶液稀释(1/40)测定zeta电位。

溶液中氧化二氮化酶活性的测定

测试催化活性通过3 3ʹ5 5ʹ-tetramethylbenzidine(三甲)测定,50μL Nr-PtMn-1, R-PtMn-1, R-PtMn-2或R-PtMn-3(50μg / mL)在50μL孵化三甲(1.5毫米)和50μL各种缓冲区(10×,pH = 5.4, 6.0, 6.4, 6.8, 7.4) 1 h。R-PtMn-1 ox-TMB的解决方案,吸收100μL孵化的混合物在不同时间点记录在650 nm紫外-可见(紫外光谱仪揭示催化活性。

将50 μL的R-PtMn-1、R-PtMn-2、R-PtMn-3 (50 μg/mL)分别置于50 μL的TMB (1.5 mM)和50 μL的HEPES缓冲液(10倍,pH = 6.0)中孵育,以测试催化活性的动态过程。不同孵育时间(0 ~ 30 min)后,用紫外-可见光谱仪记录TMBox在650 nm处的吸收情况。

测量消耗的谷胱甘肽

制备含有Nr-PtMn-1或R-PtMn-1 (50 μg/mL)和GSH (2 mM)的HEPES缓冲液(0.2 mL, 1倍,pH = 7.4, 6.4, 5.4或4.4),分别于37℃孵育12 h后离心。然后,收集50µL上清液,与50µL比色剂5,5′-二硫比-2-(硝基苯甲酸)(DTNB) [~ 1.2 mg/mL在二甲基亚砜(DMSO)中]孵育约15 min。将上述溶液稀释(1/6),在412 nm (OD)处测量吸收,通过下式1测定谷胱甘肽消耗含量:

(1)

T的测量1/ T2—放松时间

将含有R-PtMn-1、R-PtMn-2或R-PtMn-3 (Mn: 50 μg/mL)的HEPES缓冲液(0.2 mL, 1 ×, pH = 7.4、6.4、5.4、4.4)在37℃下孵育1 h,将含有R-PtMn-1 (Mn: 25、50、100、200 μg/mL)的HEPES缓冲液(0.2 mL, 5 ×, pH = 7.4、6.8、6.4、5.4、4.4)在37℃下孵育6 h,然后通过Bruker Minispec分析仪(60 MHz, Bruker,德国)检测T1或t2弛豫时间。

用于T1或t2 mri幻象成像,各种HEPES缓冲液(0.2 mL, 5 ×, pH = 7.4, 6.8, 6.4, 5.4, 4.4)含有R-PtMn-1 (Mn:12.5, 25、50、100μg / mL)在37℃培养6 h。然后,这些样本扫描通过使用力量7 T-MRI扫描仪使用T1-MRI序列(视野= 30毫米×30毫米,尺寸= 256×256,切片厚度= 0.7毫米,重复时间(TR) = 225.58毫秒,而有效回波时间(TE) = 4.5 ms)或T2-MRI序列(视野= 30毫米×30毫米,尺寸= 256×256,切片厚度= 0.7毫米,TR = 2500毫秒,TE = 35毫秒)。

细胞实验

将小鼠乳腺癌(4T1)细胞、小鼠结直肠癌(CT26)细胞作为癌细胞,人胚胎肾细胞系(HEK293细胞)作为正常细胞,在含有1%青霉素/链霉素和10%胎牛血清的Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM)中,37℃,5% CO2,培养于细胞培养板上。

细胞内ROS e估值

为了评估细胞内ROS的产生,在光学培养皿中预先播种的4T1细胞分别用Nr-PtMn-1或R-PtMn-1 (30 μg/mL)在光学培养皿中预先播种6 h。在光学培养皿中预先播种的4T1细胞分别用R-PtMn-1 (30 μg/mL)在光学培养皿中预先播种2、4或6 h。30 μg/mL)预先在光学培养皿中接种4 h。将预先在光学培养皿中接种的R-PtMn-1 (30 μg/mL)预先在光学培养皿中接种6 h, DPBS洗涤3次以上后,分别用DCFH-DA (10 μM)和Hoechst (1 μg/mL)染色0.5 h。然后用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察DCFH-DA的荧光发射(Ex = 488 nm, Em = 530 nm),检测细胞内ROS。用ImageJ软件测定相对荧光强度。

细胞内LPO e估值

为了评估细胞内LPO的产生,在光学培养皿中预先接种的4T1细胞分别用Nr-PtMn-1或R-PtMn-1 (30 μg/mL)在光学培养皿中预先接种2 h。在光学培养皿中预先接种的4T1细胞分别用R-PtMn-1 (30 μg/mL)在光学培养皿中预先接种0.5、1、1.5或2 h。在光学培养皿中预先接种的4T1细胞分别用R-PtMn-1(0、7.5、15、30 μg/mL)预接种于光学培养皿中2 h。将预接种于光学培养皿中的HEK293细胞用R-PtMn-1 (30 μg/mL)预接种于光学培养皿中2 h, DPBS洗涤3次以上后,分别用脂氟(10 μM)和Hoechst (1 μg/mL)染色0.5 h。然后用CLSM检测liperfluo (Ex = 488 nm, Em = 500 ~ 550 nm)的荧光发射。用ImageJ软件测定相对荧光强度。

Mitocho膜电位e估值

为了观察线粒体膜电位的变化,将4T1细胞预先接种于光培养皿中,分别用40 μg/mL的Nr-PtMn-1或R-PtMn-1处理2 h, DPBS洗涤3次后,用JC-1 (10 μM)染色0.5 h。用CLSM检测Ex = 585 nm, Em = 590 nm)。用ImageJ软件测定JC-1的相对荧光强度。

细胞内谷胱甘肽估值

为了检测细胞内GSH的含量,将4T1细胞在含有Nr-PtMn-1或R-PtMn-1 (30 μg/mL)的6孔板中预孵育24 h,将4T1细胞在含有R-PtMn-1(0、7.5、15、30 μg/mL)的6孔板中预孵育24 h,将4T1细胞在含有R-PtMn-1 (30 μg/mL)的6孔板中预孵育6、12、24 h,将4T1细胞破坏,将细胞裂解液用液氮冷冻,37℃下溶解3次。取上清液40 μL,在4℃(10,000 rpm, 8 min)离心后,与GSH测定试剂盒(BC1175, Solarbio)中280 μL试剂2和80 μL试剂3孵育10 min。在412 nm (OD)处,通过酶标仪检测混合物的吸收,计算GSH浓度,公式2如下:

(2)

细胞内MDA e估值

通过丙二醛(MDA)检测试剂盒检测细胞内丙二醛(MDA)含量,将预先接种于6孔板的4T1癌细胞分别与30 μg/mL的Nr-PtMn-1或R-PtMn-1孵育24 h。接下来,将这些细胞裂解并收集细胞裂解液。取上清液50 μL,在4℃(12,000 rpm, 8 min)离心后,与MDA测定试剂盒(BC0025, Solarbio)的工作液150 μL和试剂3 50 μL混合。将混合物在95℃以上煮沸1 h,冷却至室温。离心(10000 rpm, 5 min),收集上清180 μL,在450、532、600 nm (OD450、OD532、OD600)处用酶标仪测定上清的吸光度。随后,根据式3、4计算MDA含量浓度。

(3) (4)

细胞内WB测定

western blot检测GPX4、BID和ACSL4的表达,将预先播种于6孔板的4T1癌细胞分别用30 μg/mL的Nr-PtMn-1或R-PtMn-1处理约6 h。然后,用冷水DPBS洗涤细胞,收获细胞,将细胞裂解液煮沸10分钟以上,然后将蛋白质转移到0.45 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜在含有Tween 20和5%干脱脂乳(TBST)的tris缓冲盐水中阻断,与兔GPX4、BID或ACSL4抗体(1:10 00,Absin)和β-actin抗体(1:10 00,Servicebio)在4℃下孵育12 h。用TBST洗涤膜,然后用二抗(1:10 00,一山生物科技)孵育1小时以上。最后用TBST洗涤膜,用增强型化学发光检测系统捕获每个蛋白的条带。我们通过图像j量化GPX4、ACSL-4、BID和β-actin水平,以计算GPX4、ACSL-4和BID的相对水平。

细胞内细胞毒性估值

为了研究对细胞活力的抑制作用,CT26细胞和4T1细胞接受如下处理:

将预接种于96孔板的CT26细胞分别用不同浓度(0、30、60、120、240 μg/mL)的R-PtMn-1、R-PtMn-2、r - ptmn -3处理24 h。分别用R-PtMn-1 (240 μg/mL)处理96孔板预接种的4T1细胞,孵育时间分别为0、4、10、18、30 h。预接种于96孔板的4T1细胞分别用不同浓度(0、30、60、120、240 μg/mL)的Nr-PtMn-1、R-PtMn-1、R-PtMn-2、R-PtMn-3处理24 h。

预先接种于96孔板的HEK细胞分别用不同浓度(0、30、60、120、240 μg/mL)的R-PtMn-1处理24 h。

用DPBS洗涤3次后,用200 μL含MTT (0.5 mg/mL)的DMEM孵育3 h,去除溶液,每孔加入180 μL DMSO。37℃孵育0.5 h以上后,用酶标仪检测490 nm处的吸光度,按标准MTT法计算相对细胞活力。

体内肿瘤成像

所有动物实验均经湖南大学机构动物爱护与利用委员会(SYXK 2018-0006)批准。

用约50 μL的DPBS溶液皮下注射4T1或CT26肿瘤细胞(~ 1 × 106),制备BALB/c雌性小鼠肿瘤模型。

对4T1荷瘤小鼠进行体内T1或T2 MRI成像,分别ig注射Nr-PtMn-1或R-PtMn-1 (25 μL, Mn: 20 μg/mL)或静脉注射R-PtMn-1 (200 μL, Mn: 700 μg/mL)。然后,立即用异氟烷麻醉小鼠,在7台T-MRI扫描仪(PharmaScan 70/16 US, Burker)上扫描,采用T1-MRI序列(尺寸= 384 × 384,视场= 30 mm × 30 mm,层厚= 0.7 mm, TR = 230.5 ms, TE = 4.5 ms)或T2-MRI序列(尺寸= 256 × 256,视场= 30 mm × 30 mm,层厚= 0.7 mm, TR = 2500 ms, TE = 35 ms)。

体内催化癌症治疗

对于体内癌症治疗,同时进行静脉和静脉给药。将CT26荷瘤雌性小鼠随机分为4组(n = 5),给予如下给药:(1)不给药为对照组;(2) Nr-PtMn-1(25µL, Mn: 0.7毫克/毫升),(3)R-PtMn-1(25µL。内格罗蓬特:0.7毫克/毫升,信息技术),(4)R-PtMn-1(200µL, Mn: 0.7毫克/毫升,注射)。将4T1荷瘤雌性小鼠随机分为2组(n = 5),给予如下给药:(1)不治疗为对照组;(2) R-PtMn-1(200µL, Mn: 0.7 mg/mL,静脉注射)。在14天的研究中,每隔一天记录各组小鼠的体重和肿瘤体积。肿瘤体积计算为长度×宽度2/2。第14天处死各组小鼠,记录各组小鼠肿瘤重量。第2天取出代表性肿瘤,注射后第14天,按标准方案收集各组代表性小鼠的主要5个器官进行H&E和TUNEL染色,并使用Pannoramic MIDI显微镜(3DHIESTECH,匈牙利)进行检查。

对于DCFH-DA或脂氟染色,从小鼠身上收集这些组织进行冷冻切片。然后分别用DCFH-DA(10µM, Ex = 488 nm, Em = 530 nm)和DPAI (1 μg/mL, Ex = 358nm, Em = 461 nm)染色约2 h。最后,用CLSM收集这些组织的荧光共聚焦图像。用ImageJ软件测定相对荧光强度。

统计分析

统计分析以均数±标准差(SD)表示。所有实验都至少进行了三次。经学生t检验,差异有统计学意义(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001)。

数据可用性

所有相关数据均可从作者处获得。


目录

摘要。
介绍
材料与方法
结果与讨论
结论
数据和材料的可用性
参考文献。
致谢。
作者信息
道德声明







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