2023-10-19 07:30

哈萨克斯坦早发性癫痫患儿的全基因组测序揭示了新的基因变异和表型变异

摘要

在哈萨克斯坦,关于遗传性癫痫的数据不足,这有其自身的临床和管理问题。因此,本研究旨在使用全基因组测序来识别和评估哈萨克斯坦儿科人群中早发性癫痫的遗传变异和遗传结构。在这项研究中,哈萨克斯坦首次对癫痫诊断儿童进行了全基因组测序。该研究涉及2021年7月至12月期间20名患有早发性癫痫且未确定病因的儿科患者。入组时的平均年龄为34.5个月,癫痫发作时的平均年龄为6个月。男性6例(30%),家族性7例。我们在14例(70%)病例中发现了致病和可能致病的变异,其中6个新的疾病基因变异(KCNQ2、CASK、WWOX、MT-CO3、GRIN2D和SLC12A5)。与该疾病相关的其他基因有SCN1A (x2)、SLC2A1、ARX、CACNA1B、PCDH19、KCNT1和CHRNA2。70%病例的遗传原因鉴定证实了早发性癫痫病因的一般结构和在诊断中使用NGS的必要性。此外,该研究还描述了遗传性癫痫的新的基因型-表型相关性。尽管本研究存在一定的局限性,但可以得出结论,哈萨克斯坦儿童癫痫的遗传病因非常广泛,需要进一步研究。

介绍

癫痫是最常见的神经系统疾病之一,影响所有年龄、种族、社会阶层和地理位置的人。癫痫是一种慢性脑部疾病,其特征是癫痫发作的持续易感性,具有神经生物学、认知、心理和社会后果[1,2]。在一项发病率研究的系统回顾和荟萃分析中,癫痫的总发病率为每10万人年61.4例,总患病率为每1000人7.60例;低收入/中等收入国家的发病率高于高收入国家。此外,癫痫在最年轻和最年长年龄组的发病率较高,在生命的第一年,发病率为每年每10万人中有86人。尽管从1990年到2016年,该病的患病率有所下降,但癫痫仍然是导致残疾和死亡的一个重要原因。

在儿科人群中,癫痫是一种常见的神经系统疾病,影响约0.5%至1%的儿童。根据哈萨克斯坦Jaxybayeva等人的数据,截至2020年10月,在15769名儿童(0至18岁)中诊断出癫痫。在“大学医学中心”国家妇幼保健科学中心儿科神经内科住院的450例癫痫患者中(占住院总人数的32%);公司发现(CF)在2013年至2014年间,其中170人被诊断为癫痫性脑病[7]。早发性癫痫与不良的长期社会心理结局有关,其影响会持续到成年期。儿童期癫痫患者的失业率较高,受教育程度较低,社会经济地位较低[5,8,9]。据Lepessova和Myrzaliyeva bbb说,在环境条件不利的地区观察到癫痫的高患病率,这强调了哈萨克斯坦儿科人群中该病流行病学的社会生态因素。

癫痫被认为是一种多因素疾病。某些形式的癫痫的遗传基础已经提出了几十年,并在20世纪90年代通过基因定位和鉴定与癫痫综合征相关的特定突变得到证实[11,12,13,14]。现有数据表明,70-80%的癫痫病例有遗传原因,其余20-30%与后天条件有关,如缺血、脑损伤、肿瘤和自身免疫性疾病[13,15]。Wang等人的一篇综述发现了977个与癫痫相关的基因。与此同时,最近的研究发现,在儿科人群中,遗传原因占了大约30%的病例。由于这个原因,基因检测在今天的实践中被癫痫病医生广泛使用。

多种遗传方法有可能应用于癫痫的诊断。一般来说,细胞遗传学检测、比较基因组杂交(arrays - cgh)和多重连接酶依赖扩增(multiplex ligase-dependent amplification, MLPA)等方法可以诊断约10%的儿童癫痫和5%的癫痫性脑病[19,20],因为大多数癫痫与个体基因突变有关。目前,可以直接测定单个基因某一区域核苷酸序列的传统Sanger测序已经被下一代测序(NGS)所取代,后者可以以相对较低的成本同时测序多个基因[21,22]。2013年至2017年在德国慕尼黑进行的队列研究表明,NGS允许医生改变63%癫痫患者的临床管理。随着测序成本的持续下降,使用WGS是临床诊断早发性癫痫性脑病[24]的有效策略。来自美国和英国的另一组研究人员使用WGS方法[25]描述了两个在大田原综合征中致病的新基因KCNT1和PIGQ。

哈萨克斯坦人全基因组测序的首个数据由Akilzhanova等人发表。后来,一项对350名早期癫痫性脑病伴智力迟钝的儿童进行的研究表明,需要为癫痫患者的基因研究提供额外的医疗资助;因此,只有15名(4.3%)研究参与者由于经济原因能够在其他国家接受NGS,其中12名(80%)具有与疾病病因和治疗耐药性相关的各种基因突变和变异。

因此,本研究旨在基于全基因组测序识别和评估哈萨克斯坦早期癫痫患儿的遗传变异。

材料与方法

研究设计:回顾性单中心研究。

伦理问题

该研究得到了当地生物伦理委员会“UMC”CF的批准,该委员会是2021年6月29日第1号议定书的摘录。

研究参与者

该研究共涉及20名无血缘关系的儿童,他们患有不明原因的癫痫和早发性疾病(根据国际抗癫痫联盟的标准),于2021年7月至12月在CF“UMC”国家妇幼保健科学中心儿科神经内科住院,符合以下纳入标准:

•3岁前癫痫发作;

•脑电图(EEG)显示癫痫样放电;

•脑磁共振成像(MRI)没有结构变化,这可能是癫痫的原因;

•精神运动发育迟缓和/或存在抗癫痫药物耐药性和/或存在严重的癫痫性脑病;

•既往遗传研究中未发现异常(核型分析);

排除研究的标准是患者在研究前或研究期间的癫痫诊断,其病因可以解释癫痫综合征。此类病因包括脑和脑膜感染、新生儿缺氧缺血性脑病、肿瘤、中度至重度脑损伤史以及影响神经系统的自身免疫性疾病。

全基因组测序

使用PromegaTM试剂盒(美国)根据制造商的协议从全血样本中提取基因组DNA。使用Illumina DNA PCR-Free Library Prep, Tagmentation protocol,使用Illumina DNA/RNA UD Set a的IDT索引,从300 ng基因组DNA中制备DNA文库,根据标准试剂盒协议,在Qubit荧光仪上使用Qubit ssDNA Assay验证DNA文库。测序在NovaSeq 6000高通量平台上进行,使用阿斯塔纳国家实验室的NovaSeq 6000 S4 Reagent Kit v1.5(300循环)。

原始数据预处理和生物信息学分析

从Illumina NovaSeq测序平台获得二进制碱基调用(binary base call, bcl)格式的原始数据文件,使用bcl2fastq工具转换为fastq文件格式。使用FastQC v.0.11.9[27]和MultiQC v.1.12[28]评估生成序列的质量。测序reads与人类参考基因组(NCBI GRCh37, hg19)使用Burrows-Wheeler Aligner v.0.7.12[29]进行比对。用于排序和标记读取重复项的Picard工具v.2.27.4。基因组分析工具包(GATK) v.3.8已用于称为[30]的基因组变异。基因组变异使用ANNOVAR[31]进行注释。

基因变异的解释

根据人类基因组变异学会(http://www.hgvs.org/mutnomen)的命名指南描述已确定的遗传变异。变异解释遵循美国医学遗传学与基因组学学院和分子病理学协会(ACMG/AMP)推荐的5级分类系统,并在Franklin平台上进行(Franklin by Genoox, Genoox, USA)。在研究中确定的所有可能的选择都使用三个阶段的分析进行评估:

1.在人口控制数据库中按频率过滤的变异;

2.文献和数据库回顾,以寻找每一个已确定的变异在疾病的病因和病程中的作用;

3.在个别临床病例中评估所有已确定变异的致病性。

变体注释使用的数据库有:OMIM、Human Gene Mutation Database (HGMD)和ClinVar。使用多态性表型v2 (polyphenen -2)、MutationTaster和MutationAssessor预测算法预测变异的致病性。


目录


摘要
介绍
材料与方法
结果
讨论
结论
数据可用性
代码的可用性
参考文献

作者信息
道德声明

补充信息



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结果

在Illumina NovaSeq 6000平台上对20例患者的dna进行测序,测序的碱基对总数为68,8 ~ 202,7 Gb,平均每个样本为116 Gb。所有样本的平均基因组覆盖率为35X。平均而言,99.15%的测序读数已被正确地映射到参考基因组上。

“大学医学中心”СF儿科神经内科的20例早发癫痫且病因不明的儿童患者被纳入研究。男性6例(30%)。研究参与者在招募时的年龄从4个月到13岁不等,平均年龄为34.5个月。癫痫发作范围从新生儿期到3岁,平均为6个月。先证者中有7例有沉重的癫痫家族史。

在本研究招募的20例患者中,7例(35%)出现局灶性癫痫发作,5例(25%)出现强直阵挛性癫痫发作,5例(25%)出现全身性癫痫发作,2例(10%)出现多形性癫痫发作,1例(5%)出现肌阵挛性癫痫发作。队列中有5例(25%)患者出现治疗抵抗性癫痫发作,其中丙戊酸耐药3例,苯巴比妥耐药1例,苯巴比妥和卡马西平均耐药1例。5例诊断为癫痫性脑病。13例(65%)患者有精神运动迟缓,10例被诊断为言语迟缓。

在全基因组测序后,在20例中有14例(70%)确定了致病性和可能致病性的遗传变异。14例癫痫遗传病因患者的临床、表型和基因型资料见表1和表2。临床和表型数据,以及6例无临床显著变异的患者行数据在补充资料中提供。

表1 5例家族性病例的遗传诊断和表型
表2 9例非家族性病例的遗传诊断和表型

在14例已确定致病性/可能致病性基因变异的患者中,有癫痫家族史的患者占5例(病例# 1 ~ 5)。5例癫痫家族史患者的临床、表型和基因型数据见表1;这些病例的谱系图见图1。

图1
figure 1

癫痫家族史病例家系图(利用BioRender.com制作)

在病例1、2、5、6、9和10中发现了先前描述的变异(分别为KCNQ2、WWOX、SLC12A5、CASK、MT-CO3和GRIN2D基因)。病例1为女童,遗传分析时年龄为2岁。第一次,惊厥记录在生命的第二天。在该患者中,研究揭示了KCNQ2基因的致病性变异。该变异是一个46 bp的插入,随后是外显子5的移码。

病例2是一个1个月大的女孩,第一次癫痫发作。在咨询过程中,每天有30次癫痫发作,持续30秒。该患者在WWOX基因中发现复合杂合变异体。这两种基因变异以前都没有被描述过。

病例5为女童,3岁时癫痫发作;然而,脑电图显示癫痫活动较早。先证者的遗传变异表现为SLC12A5基因杂合状态的错义突变。

病例6为男童,6个月时癫痫发作。在CASK基因中发现了两个核苷酸替换(错义突变),导致Phe767Gly位置的氨基酸序列发生变化。

病例9是一名女孩,没有癫痫家族史,线粒体基因细胞色素C氧化酶3 (MT-CO3)基因有先前未描述的变异。这个女孩也有过多的皮下脂肪组织,光学病变,视盘部分萎缩。该患者的癫痫发作是通过服用丙戊酸钠来控制的。

病例10是一名女孩,7.5个月大时首次癫痫发作,背景是体温升高。该患者先前曾通过MLPA筛查微缺失/微重复综合征,结果为阴性。在这名女孩中,在GRIN2D基因中发现了先前未描述的致病性变异。

在病例4、11、12和14中发现对至少一种抗癫痫药物有耐药性。病例4对丙戊酸盐有耐药性,但癫痫发作被奥卡西平部分控制。病例11携带KCNT1基因致病性变异,对苯巴比妥和卡马西平耐药,而托吡酯和维加巴林则有部分阳性反应。病例12对苯巴比妥和低剂量丙戊酸有耐药性,而通过150 mg/天丙戊酸与100 mg/天左乙拉西坦联合用药,癫痫发作缓解。病例14最初接受左乙拉西坦治疗,但在癫痫持续状态发作前考虑了癫痫发作的频率。该患者目前正在接受丙戊酸和卡马西平的联合治疗。

讨论

这项研究描述了在哈萨克斯坦早发性癫痫儿童中进行的首次全基因组测序的结果。在研究期间,70%的病例中发现了致病性和可能致病性的遗传变异(14/20)。这一指标高于以往的研究。因此,在一项研究中,研究人员发现20%的瑞典癫痫患者(118名癫痫患儿)存在临床显著的基因突变。在韩国和苏格兰的其他研究中,纳入标准更为详细,NGS分别在37.8%和24%的早发性癫痫患者中检测到遗传异常[33,34]。本研究中发现的临床相关遗传变异百分比较高可能是由于严格的纳入标准和小样本量。

以下基因已被确定为癫痫病因:ARX、CACNA1B、CASK、CHRNA2、GRIN2D、KCNQ2、KCNT1、MT-CO3、PCDH19、SCN1A (x2)、SLC2A1、SLC12A5和WWOX。在一项早期研究中,Jaxybayeva等人在哈萨克斯坦使用全外显子组测序(CDKL5 (x3)、SCN1A (x2)、MECP (x2)、STXBP1、UBE3A、PCDH19、FOLR1、PNPO)确定了80%(12/15)早期癫痫患儿的遗传原因。综合本研究和上述研究的结果,早发性癫痫遗传病因的总体检出率为74.3%(26/35),这是可以接受的,因为纳入标准相对相似。最常见的临床显著遗传变异是CDKL5 (x3)、SCN1A (x3)、MECP (x2)和PCDH19 (x2)基因。

kcnq2相关的新生儿发病发育性和癫痫性脑病的特征主要是在出生第一周开始的强直性癫痫发作,这与病例1的临床表现相吻合。SLC2A1基因突变引起的GLUT1缺乏症以婴幼儿早期癫痫、发育迟缓、小头畸形、复杂运动障碍及各种发作性神经现象为特征[36,37],这也与指征病例相对应7。本研究也拓展了对ARX基因突变临床特征的认识。x连锁婴儿痉挛综合征、West综合征、大田原综合征和肌阵挛性癫痫综合征可能与ARX基因突变有关,其特征为儿童癫痫、智力残疾、发育和语言迟缓、难治性癫痫发作、张力低下、精神异常、脑畸形和生殖器模糊[38,39,40,41]。先前描述的与MT-CO3 (COX)基因相关的变异表现为以下临床特征:MELAS综合征、横纹肌溶解、线粒体肌病伴乳酸酸中毒和Leigh综合征([42,43,44,45,46])。在本研究中,我们扩大了mt - co3相关Leigh综合征的临床表现。此外,目前的研究证实并扩展了以下疾病的基因型-表型相关性:pcdh19相关癫痫[47]、grin2d相关发育性和癫痫性脑病[48]、kcnt1相关癫痫[49]、chrna2相关常染色体显性睡眠相关高运动性癫痫[50]、scn1a相关癫痫[51]、slc12a5相关癫痫[52]。

同时,病例6与先前描述的表型表现不同。因此,CASK基因的变异是导致癫痫伴有小头畸形、脑桥和小脑发育不全的主要原因,通常影响女性[53]。先前描述的与WWOX基因变异相关的神经系统疾病的基因型-表型相关性与脊髓小脑性共济失调12型、早期婴儿癫痫性脑病和自闭症谱系障碍有关[54,55]。在目前的研究中,wwox相关性癫痫在MRI图像上表现为精神运动迟缓、痉挛性共济失调和大脑半球脑病。受CACNA1B变异影响的个体表现为癫痫性脑病、严重的神经发育迟缓、多动运动障碍(肌挛缩-肌张力障碍综合征)、产后小头畸形和低斜视[56,57]。然而,CACNA1B复合杂合变异体病例6出现全面性强直性癫痫发作、精神运动和语言迟缓。

癫痫病因鉴定的重要成果之一是基于基因检测结果的精准医学的应用。在确定的14例遗传性癫痫中,有8例(57%)需要靶向治疗[22,58]。结果证实了遗传诊断方法,特别是NGS对癫痫患者管理的重要性。

毫无疑问,该研究不是基于人群的,参与者数量有限(n=20),并且有严格的纳入标准。在这方面,获得的高遗传病因检测百分比并不能反映哈萨克斯坦癫痫的遗传结构。然而,在研究期间调整的纳入标准使得确定一种具有成本效益的癫痫诊断算法成为可能。

结论

结果表明,NGS在早发性癫痫的诊断和治疗中具有重要意义。此外,该研究补充了关于癫痫基因型-表型相关性的现有知识,并强调了在哈萨克斯坦引入和扩大NGS诊断的必要性。

补充信息

ESM 1



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