2023-10-19 07:00

鼠皮醇可减轻2,4-二硝基氯苯/棘球蛾提取物诱导的小鼠特应性皮炎样皮肤炎症

摘要

背景

特应性皮炎(AD)是一种慢性炎症性皮肤病,广泛影响儿童和成人,表现为瘙痒、红斑、脱屑和干燥等症状。Lupeol是一种五环三萜,具有抗炎和抗菌活性。基于这些特性,人们积极研究了芦皮醇对皮肤疾病的治疗作用。在本研究中,我们旨在确定lupeople对AD的有效性。

方法

我们利用肿瘤坏死因子(TNF)-α/干扰素(IFN)-γ刺激的角质形成细胞和2,4 -二硝基氯苯/棘球蚴提取物(DFE)诱导的AD小鼠来证实其作用。

结果

Lupeol通过降低促炎细胞因子和趋化因子的表达来抑制TNF-α/IFN-γ刺激的角质形成细胞的活化,促炎细胞因子和趋化因子是由信号转导器和转录激活因子1、丝裂原活化蛋白激酶(p38和ERK)和核因子-κB等信号分子的活化介导的。口服芦皮醇抑制耳组织表皮和真皮增厚和免疫细胞浸润。血清中免疫球蛋白(Ig) E(总和dfe特异性)和IgG2a水平也被芦皮醇降低。耳组织中辅助性T (Th) 2细胞因子、Th1细胞因子和促炎细胞因子的基因表达和蛋白分泌均降低。

结论

这些结果表明,芦皮醇对ad相关反应具有抑制作用。因此,芦皮酮可能是一种很有前途的治疗阿尔茨海默病的药物。

背景

特应性皮炎(AD)是一种在世界范围内日益流行的皮肤炎症性疾病。阿尔茨海默病通常发生在儿童早期,持续到成年,有时也开始于成年[2,3]。这是最常见的皮肤病,对患者的生活造成了重大负担。此外,一些研究表明,AD引起各种过敏性疾病,如哮喘和变应性鼻炎的大多数患者[5]。

AD的发病机制与皮肤屏障功能障碍和免疫反应异常有关,涉及遗传、环境和心理因素[6]。多种因素引起的皮肤屏障功能障碍使屋尘螨(HDMs)等过敏原进入[7,8]。活化的角质形成细胞产生白细胞介素(IL)-1β和IL-6等促炎细胞因子和CC趋化因子配体(CCL) 17和CCL22等趋化因子,吸引免疫细胞进入皮肤病变,加重AD[9,10]。在AD急性期,过敏原主要诱导辅助性T细胞(Th) 2免疫应答,如分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子,导致免疫球蛋白(Ig) E类转换和免疫细胞浸润[11]。此外,th2相关的细胞因子调节聚丝蛋白的表达,导致皮肤屏障缺陷[12]。当AD进展到慢性期时,Th1反应也随着干扰素(IFN)-γ[13]的分泌而增加。进入皮肤病变的免疫细胞分泌炎症介质,激活角质形成细胞并加剧炎症反应。因此,调节角质形成细胞和免疫细胞的炎症反应是AD的主要治疗方法。

通常,糖皮质激素、钙调磷酸酶抑制剂和抗组胺药被用作AD bbb的治疗剂。另一方面,持续使用会导致一系列副作用,包括皮肤萎缩、胃炎、肾上腺功能不全、体重增加和情绪不稳定。因此,迫切需要开发一种既具有治疗效果又具有安全性的替代药物。

Lupeol是一种天然存在的三萜,存在于各种水果、蔬菜和药用植物中,具有广泛的抗炎症、过敏、微生物活性、氧化应激和癌症的药理活性[17,18,19]。经证实,枇杷醇可抑制12- o -十四烷醇-13-乙酸酯诱导炎症的各种炎症反应。先前的一项研究也报道了lupeol对哮喘(一种与Th2免疫反应[21]相关的慢性炎症性疾病)具有治疗潜力。此外,最近也有研究基于其药理活性研究了芦荚醇对痤疮、伤口和黑色素瘤等皮肤疾病的作用[22,23,24]。虽然芦荚醇对炎症性疾病和皮肤疾病有多种治疗作用,但其对ad样皮肤炎症的疗效尚未确定。在本研究中,我们根据其已知的性质,集中研究了芦皮醇作为AD治疗剂的适用性。根据我们的研究,我们可以扩大lupeol的药理活性范围,特别是作为AD的替代治疗候选药物。

方法

试剂

Lupeol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)溶解在二甲亚砜(DMSO)中进行细胞实验,溶解在含有0.5%羧甲基纤维素钠的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行动物实验。图1a描绘了芦皮醇的化学结构。2,4 -二硝基氯苯(DNCB)溶解在丙酮和橄榄油(3:1)的混合物中,将Dermatophagoides farinae提取物(DFE, Prolagen, Seoul, Republic of Korea)溶解在含0.5% Tween 20的PBS中。除非另有说明,其他试剂均购自Sigma-Aldrich。

图1
figure 1

芦皮醇的化学结构及诱导AD的实验方案。(A)鹿皮醇的化学结构。(B)研究的实验设计。第一周双耳涂2% DNCB(20µl/双耳)致敏。两耳每周分别应用1% DNCB(20µl/每耳)1次和1 mg/ml DFE(20µl/每耳)2次,共3周。诱导2周后,每周口服6次载药、lupeol或Dexa

细胞培养

HaCaT (CLS Cell Lines Service)是一种人角质形成细胞系,在Dulbecco改良Eagle培养基(Gibco, Grand Island, NY, USA)中培养,培养基中含有10%热灭活胎牛血清(Gibco), 100 U/ml青霉素G和100µG /ml链霉素,在5% CO2中,37℃。重组肿瘤坏死因子(TNF)-α和IFN-γ购自R&D Systems (Minneapolis, MN, USA),用于刺激HaCaT细胞。

细胞生存能力

采用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)测定法测定细胞活力。将HaCaT细胞以每孔1 × 104个细胞的密度接种于96孔板中,并稳定过夜。然后,HaCaT细胞与不同浓度的lupeol(0-100µM)或DMSO(0.5%)孵育24小时。随后,在每孔中加入20µl MTT溶液(5 mg/ml PBS),孵育4小时。将甲醛晶体溶解于100µl DMSO中,使用分光光度计(VersaMax™Microplate Reader, Molecular Devices, San Jose, CA, USA)在570 nm处测量吸光度。与未处理组(100%)比较,测定细胞活力。

动物

BALB/c小鼠(雌性,4周龄,n = 35)由Dae-Han实验动物中心(大韩民国大田)提供,在繁殖室每笼饲养5只小鼠。室温为22±2℃,相对湿度为55±5%,光照/黑暗周期为12 h。在实验开始前,小鼠被维持了一周。动物研究是按照reach指南和公共卫生服务政策关于实验动物的人道关怀和使用指南进行的。该实验已获得庆北国立大学机构动物护理和使用委员会(IRB # 2021-0073)的批准。

诱导ad样皮肤炎症

为了诱导ad样皮肤炎症,我们遵循图1B所示的步骤。将小鼠随机分为7组(n = 5/组):第一组(PBS加0.5%羧甲基纤维素钠),第二组(PBS加0.5%羧甲基纤维素钠)。氟哌啶醇10mg /kg, III组。DNCB/DFE加药组,IV组,DNCB/DFE加lupeol 0.1 mg/kg, v组,DNCB/DFE加lupeol 1 mg/kg, VI组,DNCB/DFE加lupeol 10 mg/kg, VII组。DNCB/DFE加地塞米松(Dexa) 1mg /kg。在本研究中,Dexa作为阳性药物对照。第一周,双耳涂2% DNCB(20µl/双耳)致敏。两耳每周分别用1% DNCB(20µl/每耳)1次和1 mg/ml DFE(20µl/每耳)2次处理,共3周。诱导两周后,每周口服6次载药、lupeol或Dexa。DNCB/DFE应用24小时后,用表盘测量耳厚(Mitutoyo, Tokyo, Japan)。第28天CO2安乐死,取腹主动脉全血。血液凝固2 h后,1000 × g离心15 min,采集血清。取小鼠耳进行组织学观察、RT-qPCR和ELISA检测。取肝、肾确认毒性。

RT -聚合酶链反应

用RNAiso Plus试剂盒(Takara Bio,滋贺,日本)从HaCaT细胞和小鼠耳组织中分离总RNA。在24孔板上以每孔2 × 105个细胞的密度接种HaCaT细胞,用lupeol(0.1、1或10µM)或Dexa(10µM)处理。2小时后,用10 ng/ml TNF-α和IFN-γ刺激HaCaT细胞6小时。耳组织使用Tissue Lyser II (Qiagen, Hilden, Germany)均质。使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)定量样品的总RNA,然后使用RevertAid RT Kit (Thermo Fisher Scientific)合成cDNA。随后,使用SteponePlus实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)进行RT-qPCR,每个引物0.3µM(见表1)和2X QGreenBlue Master混合液(Cellsafe, Yong-in, Republic of Korea)。扩增条件为:95℃下3 min, 95℃下10 s, 60℃下30 s,循环40次,然后进行熔化曲线分析。将基因表达归一化为甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH),使用SteponePlus PCR系统软件v2.3进行分析。

表1 RT-的引物对序列聚合酶链反应

ELISA

采用ELISA试剂盒(R&D Systems)检测刺激HaCaT细胞条件培养基中分泌的IL-1β、IL-6、CCL17和CCL22的水平。在24孔板上以每孔2 × 105个细胞的密度接种HaCaT细胞,用lupeol(0.1、1或10µM)或Dexa(10µM)处理。2 h后,用10 ng/ml TNF-α和IFN-γ刺激HaCaT细胞24 h,上清液在4℃下1000 × g离心5 min。然后按照制造商的规程对样品进行分析。

根据制造商的说明(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA),使用ELISA试剂盒检测血清中IgE(总IgE和dfe特异性IgE)和IgG2a水平。为了检测DFE特异性IgE,在PBS中预涂30µg/ml的DFE,并根据制造商的IgE说明进行以下步骤。

耳部组织用提取缓冲液(100 mM Tris;pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100和0.5%脱氧胆酸钠),加入蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche, basel, Switzerland)和1 mM苯基甲基磺酰氟(使用Tissue Lyser II)。匀浆在18000 × g下离心15分钟,去除碎屑。采用ELISA试剂盒检测耳组织匀浆上清液中IL-4 (BD Biosciences)、IFN-γ和IL-1β (Invitrogen, Waltham, MA, USA)蛋白水平。在450nm处用分光光度计测定吸光度。

免疫印迹

HaCaT细胞在6孔板上以每孔1 × 106个细胞的密度接种,用lupeol(10µM)或Dexa(10µM)处理。2小时后,用10 ng/ml TNF-α和IFN-γ刺激HaCaT细胞15分钟。用裂解缓冲液(20 mM Tris, 137 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10%甘油,1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF和1 mM Na3VO4)添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)制备总蛋白提取物。裂解液超声60 s, 4℃下18000 × g离心20 min。从上清液中收集总蛋白。细胞质和核蛋白与每个缓冲液分离。首先,用加入蛋白酶抑制剂混合物的细胞质裂解缓冲液(150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF和0.5% Triton X-100)收集细胞。裂解液在4℃下2500 × g离心5分钟后,从上清液中收集胞质蛋白。剩余的微球用PBS洗涤,然后悬浮在核裂解缓冲液中(420 mM NaCl, 20 mM HEPES, 0.2 mM EDTA, 1.2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF和25%甘油)。将悬浮微球超声处理后,在4℃下18000 × g离心20 min。从上清液中收集核蛋白。使用Bradford检测试剂盒(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)对蛋白质进行定量。从同一实验中得到的蛋白质样品,然后用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,并平行转移到硝化纤维素膜(Pall Life Sciences, Port Washington, NY, USA)。用阻断缓冲液(4%牛血清白蛋白在tris缓冲盐水中加入0.1% Tween 20)在室温下阻断膜1小时,用一抗在4℃下孵育过夜。然后,将膜与二抗在室温下孵育1h。实验使用的抗体如表2所示。采用G: BOX Chemi XRQ (Syngene, Cambridge, UK)和SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物(Thermo Fisher Scientific)进行检测。使用Image J软件v1.8.0进行密度分析,用于分析的印迹见附加文件1。

表2 Western blot所用抗体

组织学分析

将小鼠耳、肝、肾固定在10%福尔马林溶液中进行组织学分析。组织包埋于石蜡中,切成5 μm厚度。切片分别用苏木精和伊红(H&E)染色4 min和2 min,甲苯胺蓝染色1 min 30 s。在×200放大下,在h&e染色切片中随机选择5个部位测量表皮和真皮层的厚度。在×400放大下,分别在H&E-和甲苯胺蓝染色切片随机选取5个区域,计数耳组织中嗜酸性粒细胞和肥大细胞的浸润数量。在×200放大下用H&E染色的肝脏和肾脏切片证实了器官的毒性。

免疫组织化学(包含IHC)

耳部组织切片用二甲苯去蜡化。然后,用分级乙醇溶液再水合切片,用去离子水冲洗。用Tris-EDTA缓冲液(10 mM Tris碱基,1 mM EDTA溶液,0.05% Tween 20, pH 9.0)微波提取抗原15分钟。为了消除内源性过氧化物酶活性,切片用3%过氧化氢处理10分钟。切片用阻断缓冲液(5%正常山羊血清,PBS, 0.05% Tween 20)在室温下阻断1小时,然后用抗CD4一抗(1:500,Abcam, Cambridge, UK)在4℃下孵育过夜。接下来,生物素化二抗(1:20 00,Vector Laboratories, Newark, CA, USA)应用30分钟,ABC-AP (Vector Laboratories)试剂应用30分钟。随后,切片与AP底物孵育20分钟,室温下苏木精反染色1分钟。在×400放大镜下观察ihc染色切片。

统计分析

使用Prism 7 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)进行统计分析。结果以均数±标准误差(SEM)表示。采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验评价治疗效果。P < 0.05为差异有统计学意义。


目录


摘要
背景
方法
结果
讨论
结论
数据可用性
缩写
参考文献
致谢

作者信息
道德声明





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结果

芦皮酮对前体的影响促炎性细胞因子和趋化因子在TNF-α/IFN-γ刺激的角质形成细胞中的表达

在AD病变中,活化的角质形成细胞通过释放炎性介质如促炎细胞因子和趋化因子[9]而加剧AD的发病。因此,我们使用TNF-α/IFN-γ刺激的HaCaT细胞来证实lupeol对活化的角质形成细胞的影响。首先,采用MTT法验证芦皮醇的细胞活力。Lupeol在HaCaT细胞中显示高达10µM的毒性(附加文件2A)。随后分别采用RT-qPCR和ELISA分析促炎因子(IL-1β和IL-6)和趋化因子(CCL17和CCL22)的基因表达和分泌情况。TNF-α/IFN-γ刺激后,IL-1β、IL-6、CCL17、CCL22基因表达水平升高。另一方面,lupeol预处理以浓度依赖的方式降低了升高值,这些作用与Dexa处理的效果接近(图2A)。促炎细胞因子和趋化因子的分泌也表现出与基因表达相似的趋势(图2B)。

图2
figure 2

芦皮醇对TNF-α/IFN-γ刺激的角质形成细胞中促炎细胞因子和趋化因子表达的影响。(A)通过RT-qPCR检测细胞因子和趋化因子的基因表达。HaCaT细胞(24孔板中2 × 105个细胞/孔)分别用lupeol(0.1、1或10µM)或Dexa(10µM)预处理2 h,然后用10 ng/ml TNF-α和IFN-γ刺激6 h。基因表达标准化为GAPDH。(B) ELISA法测定蛋白分泌量。HaCaT细胞(24孔板中2 × 105个细胞/孔)用lupeol(0.1, 1或10µM)或Dexa(10µM)预处理2小时,然后用10 ng/ml TNF-α和IFN-γ刺激24小时。数据以平均值±SEM表示(n = 3)。# # # p < 0.001和诈骗集团* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001与肿瘤坏死因子-α/干扰素-γ刺激组。案子,控制;未检测到ND

芦皮醇对TNF-α/IFN-γ刺激的角质形成细胞中信号分子激活的影响

各种炎症介质的产生,包括IL-1β、IL-6、CCL17和CCL22,受信号传导分子如转录信号传导和激活因子1 (STAT1)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和核因子(NF)-κB等调控[25,26,27]。因此,我们研究了芦皮醇在炎症介质表达中的调节机制。TNF-α/IFN-γ处理HaCaT细胞显著增加STAT1、MAPKs (p38和ERK)的磷酸化和NF-κB的核易位,而芦皮醇抑制磷酸化(图3A)和核易位(图3B)。此外,与对照组一样,仅lupeol(10µM)处理组的信号分子未被激活。这些结果表明,lupeol通过阻断角质形成细胞中的信号分子来降低促炎细胞因子和趋化因子的表达。

图3
figure 3

芦皮醇对TNF-α/IFN-γ刺激的角质形成细胞中STAT1、MAPKs和NF-κB活化的影响。(A) Western blot检测STAT1、MAPKs (p38和ERK)磷酸化和(B) NF-κB p65核易位。HaCaT细胞(6孔板中1 × 106个细胞/孔)用lupeol(10µM)或Dexa(10µM)处理2 h,然后用10 ng/ml TNF-α和IFN-γ刺激15 min。样品来源于同一实验,凝胶/印迹平行处理。以总形态、α-微管蛋白和TBP作为加载对照。每个印迹是三个独立实验的代表性结果。所有原始斑点都显示在附加文件1中。利用Image J软件测量波段强度,计算与TNF-α/IFN-γ刺激组比较的蛋白相对比值。数据以平均值±SEM (n = 3)表示。p < 0.05 #和# # # p < 0.001和诈骗集团* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001与肿瘤坏死因子-α/干扰素-γ刺激组。案子,控制;p -,磷酸化

芦皮醇对ad诱导小鼠表型的影响

红斑、脱屑、水肿和地衣变是AD[28]的常见表型。使用根据实验方案创建的AD小鼠模型(图1B)研究了lupeol对AD表型的影响。DNCB和DFE诱导2周后,口服载药、lupeol(0.1、1或10 mg/kg)或Dexa (1 mg/kg)。在试验期间,给药组体重无明显变化(附加文件2B)。此外,口服lupeol (10 mg/kg)不会引起肝脏和肾脏器官重量和组织学分析的变化(附加文件2 C和D),表明lupeol在10 mg/kg以下没有毒性。随着DNCB/DFE的持续应用,AD的红斑、结垢、水肿等表型越来越严重。然而,lupeol以剂量依赖的方式缓解了这些表型(图4A)。增加的耳厚在1 mg/kg组明显恢复,在10 mg/kg组更明显(图4B)。这些结果表明,lupeol减轻了AD的表型,包括红斑、脱屑和水肿。

图4
figure 4

芦皮醇对ad诱导小鼠表型的影响。(A)各实验组小鼠AD病变的代表性照片。(B) DNCB/DFE应用后24 h用表盘测量耳厚。数据以平均值±SEM (n = 5)表示。与CON组比较,###p < 0.001,与ad诱导组比较,*p < 0.05, ***p < 0.001。案子,控制

芦皮醇对ad诱导小鼠组织学改变的影响

在组织学观察中,AD病变的特点是表皮和真皮厚度增加,免疫细胞向真皮层浸润[29,30,31]。因此,我们分析了芦皮醇对小鼠耳组织组织学变化的影响。H&E染色法测定表皮和真皮层厚度。口服lupeol可以减少耳膜厚度的增加,这与耳膜厚度的影响相似(图5A第1页和B)。H&E染色计算嗜酸性粒细胞的浸润(图5A第2页和C),甲苯胺蓝染色计算肥大细胞的浸润(图5A第3页和C)。免疫组化染色观察CD4+免疫细胞浸润(图5A第4组和C)。DNCB/DFE诱导后,真皮内浸润免疫细胞增多。然而,免疫细胞的数量,包括嗜酸性粒细胞、肥大细胞和CD4+免疫细胞明显减少。结果,lupeol减轻了AD小鼠模型的组织学改变,包括表皮和真皮增厚和免疫细胞浸润。

图5
figure 5

芦皮醇对ad诱导小鼠组织学改变的影响。(A) ×200放大后h&e染色耳组织的代表性显微照片(第1图,比例尺:100 μm)。用H&E(第二张图)、甲苯胺蓝(第三张图)和CD4抗体(第四张图)在×400放大(比例尺:50 μm)下染色的代表性耳组织显微照片。每个免疫细胞用箭头表示。(B)用千分尺测定h&e染色组织载玻片的表皮和真皮厚度。(C)分别在H&E-、甲苯胺蓝-和CD4抗体染色的载玻片上计数嗜酸性粒细胞、肥大细胞和CD4+免疫细胞浸润到真皮层的数量。数据以平均值±SEM (n = 5)表示。# # # p < 0.001和诈骗集团* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001和AD-induced组。案子,控制

图6
figure 6

芦皮醇对ad诱导小鼠免疫球蛋白和细胞因子表达的影响。(A)各组实验小鼠处死后取腹主动脉血。采用ELISA法检测血清总IgE、dfe特异性IgE、IgG2a水平。(B)取自实验小鼠的双耳。用RNAiso Plus试剂盒从耳中分离RNA,合成cDNA。RT-qPCR检测基因表达。(C)用组织提取缓冲液匀浆小鼠耳,用ELISA法测定耳组织匀浆上清液中细胞因子水平。数据以平均值±SEM (n = 5)表示。# # # p < 0.05, p值均< 0.01,# # # p < 0.001和诈骗集团* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001和AD-induced组。案子,控制;od,光密度

芦皮醇对免疫球蛋白和细胞因子的影响ad诱导小鼠的压力

过度的Th2反应主要在AD急性期观察到,而在慢性期观察到混合的Th1/Th2反应[32,33]。因此,为了确认lupeol是否影响AD小鼠的Th2和Th1反应,我们使用ELISA检测血清中IgE和IgG2a的水平。此外,我们还证实了DFE刺激产生的DFE特异性IgE水平。反复应用DNCB/DFE可提高血清中所有这些免疫球蛋白的水平。然而,lupeol降低了升高的IgE(总IgE和dfe特异性IgE)和IgG2a水平,并且仅lupeol (10 mg/kg)没有变化(图6A)。

在AD病变中,炎症细胞释放的细胞因子加剧了炎症[14,34]。因此,我们采用RT-qPCR检测了ad诱导小鼠耳组织中作为Th2细胞因子的IL-4、IL-5和IL-13,作为Th1细胞因子的IFN-γ和il - 12a,以及作为促炎细胞因子的IL-1β的基因表达水平。ad样皮肤炎症的诱导上调了所有基因的表达。另一方面,芦皮醇以剂量依赖的方式降低了增加的基因表达(图6B)。用ELISA法测定了具有代表性的Th2细胞因子(IL-4)、Th1细胞因子(IFN-γ)和促炎细胞因子(IL-1β)在耳组织中的分泌情况,发现其与基因表达有相似的趋势(图6C)。在本研究中,鹿皮醇抑制血清免疫球蛋白和耳组织细胞因子水平升高。这些结果表明,lupeol通过抗炎作用抑制ad样皮肤炎症。



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