2023-10-19 07:00

间充质干细胞通过抑制TGF-β-SMAD2/3通路可逆地将肌成纤维细胞分化为成纤维细胞样细胞

摘要

背景

肌成纤维细胞(Myofibroblasts, MFB)是病理性纤维化的主要效应因子之一,主要来源于成纤维细胞向肌成纤维细胞转化(myofibroblast transition, FMT)的激活。虽然mfb历来被认为是终末分化细胞,但最近认识到其去分化的潜力,并暗示其在治疗纤维化疾病(例如特发性肺纤维化(IPF)和异基因造血干细胞移植后闭塞性细支气管炎(BO))方面具有治疗价值。在过去的十年中,有几种方法被报道可以阻断或逆转MFB分化,其中间充质干细胞(MSC)已显示出潜在的治疗价值,但尚未确定。然而,msc介导的FMT调控及其潜在机制在很大程度上仍未明确。

方法

通过确定TGF-β1高血压是促纤维化FMT过程中的关键标志,建立TGF-β1诱导的MFB和MSC共培养模型,研究MSC对体外FMT的调节作用。方法包括RNA测序(RNA-seq)、Western blot、qPCR和流式细胞术。

结果

我们的数据显示TGF-β1很容易诱导在纤维化组织中发现的侵袭性特征,并在正常FB中启动MFB分化。MSC通过选择性抑制TGF-β-SMAD2/3信号通路,将MFB可逆地去分化为一组fb样细胞。重要的是,这些增殖促进的fb样细胞仍然对TGF-β1敏感,并且可以被重新诱导成MFB。

结论

我们的研究结果强调了MSC通过TGF-β-SMAD2/3信号介导MFB去分化的可逆性,这可能解释了MSC治疗BO等纤维化疾病的临床疗效不一致的原因。这些去分化的fb样细胞仍然对TGF-β1敏感,除非纠正促纤维化微环境,否则可能进一步恶化MFB表型。

介绍

肺纤维化是特发性肺纤维化(IPF)和异基因造血干细胞移植后闭塞性细支气管炎(post- hsct BO)等一系列致命性肺部疾病的主要病理特征(Verleden et al. 2016;Wang and Yang 2022)。目前的范式假设这些疾病起源于MFB分化的病理激活和随后的细胞外基质(ECM)沉积,最终导致肺功能丧失和死亡。据报道,治疗肺纤维化的新药,如吡非尼酮和尼达尼布,可以减缓肺纤维化的进展(Wang and Yang 2022;Costabel et al. 2017;Richeldi et al. 2018)。然而,这些药物已被证明只能延缓疾病的进展,而不能逆转最终呼吸衰竭的自然过程。对这些令人沮丧的结果的一个潜在解释可能是,现有的治疗方法无法逆转已建立的纤维化或消除纤维化组织中的促纤维化微环境(Bargagli et al. 2019)。迫切需要针对已建立的纤维化进行有效的治疗,从而避免肺移植。

肌成纤维细胞(MFB)是病理性纤维化的核心效应细胞和细胞外基质(ECM)的生产车间(Kuhn and McDonald 1991)。局部fmt来源的MFB细胞是BO的主要病理效应细胞(Costabel et al. 2017;Bargagli et al. 2019), FB表型改变,表达成纤维细胞和平滑肌谱系标记,如波形蛋白和a-平滑肌肌动蛋白(a- sma)。与未分化成纤维细胞相比,这些细胞似乎具有收缩特性以及增强的基质生成能力,导致细胞外基质(ECM)沉积和气道重塑,进一步导致组织瘢痕形成、细支气管结构扭曲和不可逆转的功能丧失(Verleden et al. 2016)。MFB分化/转化失调、增殖失控和细胞凋亡逃逸是纤维化的重要机制(Bargagli et al. 2019;Kuhn and McDonald 1991;Fortier et al. 2021)参与肺纤维化的发生和发展。因此,mfb靶向治疗可能是治疗BO的一种有前景的策略(Fortier et al. 2021)。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)具有强大的免疫调节、抗炎、抗纤维化特性,已广泛应用于纤维化疾病的治疗。Zheng等人发现,人脂肪来源的MSC静脉注射可缓解闭塞性细支气管炎(Zheng et al. 2017)。几项临床研究表明,骨髓间充质干细胞输注是hsct后BO的一种有效且安全的治疗选择(Zhou et al. 2010;Chen et al. 2019)。尽管骨髓间充质干细胞治疗BO的结果很有希望,但骨髓间充质干细胞相关疗效的持续时间并不令人满意。灌注的MSC与残余MFB细胞之间的详细相互作用在很大程度上尚未被研究。根据我们之前的报道,MSC输注在缓解难治性慢性移植物抗宿主病患者的皮肤、口腔、眼睛和胃肠道综合征方面显示出一定的疗效。然而,MSC输注后BO综合征未见治疗反应(Weng et al. 2010)。阐明msc介导的FMT过程的调控作用可能有助于阐明异质性临床结果,从而为治疗BO提供新的策略。

本研究包括解决这些问题的三个主要工作部分。提取纤维化肺FB样本的RNA-seq数据集,以确定FMT过程中的中心事件。建立MFB诱导和脐带源性间充质干细胞(uMSC)共培养模型,探讨uMSC对体外FMT的调控作用。最后,采用RNA-seq、qPCR、Western blot和流式细胞术研究FMT的细胞间调控。我们的研究结果为uMSC介导的FMT调控提供了认知图式,这可能有助于促进uMSC在治疗BO和其他肺纤维化疾病中的应用。

方法

o在线高通量RNA测序数据集和数据收集

经过文献筛选,从国家生物技术信息中心(NCBI) GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载肺纤维化(IPF)患者和健康供者(HD) FB样本的三个高通量RNA-seq数据集并进行分析。GSE185492数据集包括来自IPF患者(n = 12)或HD患者(n = 12)的24个肺FB样本。肺FB样本根据活检部位进一步分为尖端组(n = 12)和基础组(n = 12)。另一个数据集GSE180415包括来自IPF患者(n = 5)和HD患者(n = 4)的上肺叶9个原发性FB样本。为了进一步鉴定与纤维化进展相关的IPF-FB样本中的侵袭性特征(Geng et al. 2019),对侵袭性IPF-FB (n = 9)和非侵袭性IPF-FB (n = 9) (GSE118933)样本的转录组进行了分析。列出了每个在线数据集和相应序列平台的详细信息(附加文件1:表S1)。

细胞培养

MRC-5正常人肺FB细胞购自American Type Culture Collection。FB细胞用添加10%胎牛血清(FBS)(含100单位/mL青霉素和100 ug/mL链霉素)的DMEM培养。对于MFB分化,将FB在无fbs的DMEM中血清饥饿过夜,并用10 ng/mL TGF-β1 (PeroTech, USA)刺激48 h诱导MFB分化。对于MFB与uMSC的transwell共培养,在TGF-β1诱导的MFB中加入额外的uMSC饲养层,间接共培养24小时,然后进行rna测序和功能检测。根据先前的报道,MFB分化是诱导时间依赖性的,单剂量TGF-β1治疗后可保持2-4天的稳定(Hecker et al. 2011;Vaughan et al. 2000;Thannickal et al. 2003)。为了模拟TGF-β1在IPF/BO中持续升高的微环境,我们在非接触式transwell共培养体系中也维持TGF-β1浓度为10 ng/mL。

细胞制备和rna测序

使用RNEasy Kit (Qiagen, Germantown, MD)提取FB、MFB和FB样细胞的总RNA。使用Bioanalyzer 2100系统(Agilent Technologies, CA, USA)的RNA Nano 6000 Assay Kit评估RNA完整性。从总RNA中纯化mRNA并片段化,合成cDNA。提取370 ~ 420 bp的cDNA片段,用AMPure XP系统(Beckman Coulter, Beverly, USA)纯化文库片段。质量控制过程结束后,文库制剂在Illumina Novaseq平台上测序,产生150 bp的成对末端reads。所有实验均按三次重复进行。

数据分析

GSE185492和GSE180415基因表达矩阵从NCBI GEO数据库中获取。对于GSE118933,下载fastq文件测序原始数据,通过HISAT2(2.1.0版本)与人类基因组(GRCh38)进行比对,并计算原始计数(Kim et al. 2015)。采用DESeq2 (Love et al. 2014) (R包版本:1.18.1)计算差异表达基因。以校正后的p值< 0.05确定基因的差异表达。采用facotextra (R包版本:1.05)进行无监督聚类分析。使用gplots (R包,版本3.01)绘制热图。按照描述使用eVITTA进行基因集富集分析(Cheng et al. 2021)。通过ClusterProfiler (Yu et al. 2012) (R包版本3.6.0)进行富集基因本体分析(G.O.)。

RT-qPCR和Western Blot

总RNA采用Trizol (Gibco, USA)提取,cDNA采用Evo M-MLV RT Kit (Accurate Biotechnology, China)合成。采用δ CT法测定相对于内源基因GAPDH的相对基因表达量。列出检测到的基因的ID和引物序列(附加文件1:表S2)。

细胞样品用RIPA缓冲液(Gibco,美国)裂解,蛋白质用SDS-PAGE梯度凝胶(4%-20%)分离,并电印迹到PVDF膜(Millipore,德国)上。然后用兔抗gapdh (1:1000;Abcam, USA),兔抗α- sma (1:1000;Abcam, USA),兔抗col1a1 (1:1000;Abcam, USA),兔抗col3a1 (1:1000;Abcam, USA)和兔抗纤维连接蛋白(1:1000;Abcam,美国)在4°C下过夜,然后用tris缓冲盐水/Tween (TBST)冲洗三次,并在1:50 000稀释的山羊抗兔IgG二抗(CST,中国)下孵育。以GAPDH作为加载对照。

细胞活力/增殖和凋亡检测

细胞计数试剂盒-8 (CCK-8, Beyotime, China)用于估计细胞活力/增殖。重悬细胞调整至5 × 103/孔,铺放在96孔细胞培养板上,培养液为100 μL。然后在每孔中加入10 μL CCK-8,孵育2 h,使用酶标仪(Bio-Rad, CA, USA)在450 nm处测量每孔的吸光度。Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒(Sigma, USA)用于细胞凋亡检测。流式细胞术(FACS);采用B.D. Biosciences, San Jose, CA, USA)测定细胞数量和凋亡率。细胞重悬于添加2% FBS和0.1 mM EDTA的Hank平衡盐水溶液中。根据制造商的方案,在室温下,用FITC-Annexin V和PI染色细胞,定量细胞凋亡率。

统计数据

数据显示为平均值±SEM。所有实验至少进行了三次或三次以上。采用学生t检验(双侧)比较两组的差异。多重比较采用单因素或双因素方差分析,然后采用Turkey-Kramer检验。差异有统计学意义,P < 0.05。采用GraphPad Prism 7.0软件和R语言进行统计分析。


目录


摘要
介绍
方法
结果
讨论
结论
数据和材料的可用性
参考文献
致谢

作者信息
道德声明

补充信息



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结果

反式识别肺纤维化患者促纤维化FB的密码组学特征

MFB主要来源于FB,通过激活成纤维细胞-肌成纤维细胞转化(FMT) (Saito et al. 2018)。然而,FMT的分子和功能调控研究仍然很少。通过分析来自肺纤维化患者(IPF)和健康供者(HD)的患者来源的FB样本的RNA-seq数据集,我们首先确定了促纤维化转化下FB的致病特征(图1,附加文件1:表S1)。无监督主成分分析(PCA)揭示了促纤维化FB样本和正常样本(GSE185492)之间主要的转录组不一致(图2A)。在另一个肺解剖部位(GSE180415)的促纤维化FB样本中也捕获了类似的转录组不一致性(图2C)。通过使用Padj值< 0.05和log2foldchange > 0.5的临界值进行基因表达分析,在基底肺部位的IPF-FB中共鉴定出163个差异表达基因(deg)(78个上调,85个下调)(图2B)。同时,在肺上叶的IPF-FB中鉴定出639个基因(269个上调,370个下调)(图2D)。根据基于HRCT(高分辨率CT)的分类,显示IPF尖端肺部位的受累有限(Raghu等人,2022),在肺尖端部位发现IPF- fb和HD-FB之间差异不大,仅鉴定出8个deg(数据未显示)。

图1
figure 1

本研究的示意图。PCA主成分分析、DEG差异表达基因、GO基因本体分析、KEGG京都基因与基因组百科图谱、GSEA基因集富集分析、RNA-seq RNA测序、uMSC脐带源间充质干细胞、TGF-β1转化生长因子-β1、FB成纤维细胞、MFB肌成纤维细胞

图2
figure 2

IPF患者和健康供体(HD)肺FB样本转录组学特征的鉴定对来自肺尖(n = 12)和肺底(n = 12)的IPF/ hd衍生FB样本进行主成分分析,GSE185492。B火山图通过log2折叠变化(x轴)和调整p值(y轴)显示IPF-FB与基底肺部位(GSE185492) HD-FB中鉴定的DEGs。蓝点表示DEGs显著下调;红点表示DEGs显著上调;灰点表示不受显著调控的基因。C上肺叶IPF/ hd来源FB样本的主成分分析(n = 9, GSE180415)。D火山图通过log2折叠变化(x轴)和p值调整(y轴)显示IPF-FB与上肺叶部位(GSE180415) HD-FB中鉴定的DEGs。蓝点表示DEGs显著下调;红点表示DEGs显著上调;灰点表示不受显著调控的基因。E - Venn图描绘了来自不同肺解剖部位的IPF-FB样本中特异性或相互调节的deg数量。利用在肺上叶和肺基底部位的IPF-FB样本中鉴定的DEGs,用EGO进行F富集分析。G, H RNA-seq表达归一化值(外显子模型每千碱基片段数/百万个映射片段数,FPKM)在每个RNA-seq数据集中编码与TGF-β1刺激反应和肌肉组织发育相关的基因

为了确保分析的准确性和敏感性,随后的生物信息学分析仅使用来自肺基底叶和上叶的FB样本进行。在来自每个数据集的IPF-FB中鉴定的deg中,来自基底肺(3.1%)和上肺叶(12.3%)的IPF-FB只有20个deg是共享的,并且在所有三个肺部位都没有相互鉴定的deg(图2E)。在IPF-FB样本中发现的共享deg主要表明纤维化疾病的侵袭性特征(GPNMB, TENM3) (Palisoc et al. 2022;Athwal et al. 2018;Murakami et al. 2010),细胞黏附(LIMS1) (Sandfort et al. 2010;Stanchi et al. 2009),细胞周期(MDGA1) (Lu et al. 2008)和血管生成(SPHK1) (Wang et al. 2021)(图2G, H)。基于DEGs集,49和21个EGO(富集基因本体)术语在肺上叶和肺基底部位的IPF-FB中富集(Padj < 0.05),而没有一个术语在肺尖部位的IPF-FB中富集(图2F)。这些EGO术语主要反映了细胞功能的丰富,包括肌肉组织发育(图2F,橙色)和ECM重塑(图2F,蓝色)。先前的研究强调TGF-β1在启动和维持MFB和纤维化中的关键作用(Saito et al. 2018;Aschner and Downey 2016)。与这些报道类似,我们的分析也揭示了一个突出的特征,反映了细胞对TGF-β1的反应(图2F,红色),这强调了TGF-β1对观察到的FMT病理特征的潜在贡献。

TGF-β1在正常FB中诱导侵袭性特征并启动MFB分化

为了评估鉴定的促纤维化因子TGF-β1对正常肺FB细胞功能和转录组的影响,我们用TGF-β1或DMSO处理MRC-5人肺FB细胞48小时,并进行rna测序(图3A)。TGF-β1处理导致正常FB中2353个deg(上调1164个,下调1189个)(图3B)。与肺纤维化患者FB样本相似,这些TGF-β1处理的FB细胞表现出MFB分化和ECM重塑的启动(图3E,红色)。

图3
figure 3

体外给药TGF-β1诱导正常肺FB样本侵袭性IPF-FB特征。体外TGF-β1诱导和随后的uMSC共培养模型示意图。正常肺FB分别用10 ng/mL的TGF-β1或DMSO处理,然后进行rna测序和体外检测。B火山图显示MFB与未处理FB中已鉴定的DEGs,通过log2折叠变化(x轴)和调整p值(y轴)进行比较。C火山图显示侵袭性IPF-FB (n = 9)与非侵袭性IPF-FB (n = 9, GSE118933)通过log2折叠变化(x轴)和调整P值(y轴)比较鉴定的DEGs。D维恩图描述侵袭性IPF-FB和MFB样本中特异性或相互调节的deg数量。E丰富的基因本体分析(EGO),涉及MFB中鉴定的deg的生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞成分(CC) (MFB vs. FB)。F Circos图显示了最显著富集的EGO项和参与各过程的相关deg。图左侧显示deg的符号,并以颜色表示其折叠变化值(红色表示上调,蓝色表示下调)。转录本的G RNA-seq表达归一化值(FPKM)编码与FB、iMFB和共培养MFB中TGF-β信号、肌肉/纤维蛋白发育相关的基因

有趣的是,TGF-β1也容易诱导病理性侵袭性转录组,这在患者来源的浸润性纤维化FB样本中可以看到。通过比较来自GSE118933数据集的侵袭性FB样本中的转录组(图3C),在正常FB样本中,高达41.1%(522/1269)的侵袭性IPF-FB中鉴定的deg同时被TGF-β1诱导(图3D)。在TGF-β1处理的FB中,最显著富集的EGO项和这些重叠的DEGs的折叠变化表明,其功能包括“收缩纤维”(GO:0043292)、“肌原纤维”(GO:0030016)和“细胞-底物连接”(GO:0030055)的激活(图3F)。在这些EGO术语之后,TGF-β1信号转录物的表达上调(Turner et al. 2019;Baudier et al. 2018;Zheng et al. 2022) (FLNB, 1.51倍变化;ROCK1, 1.17倍变化)和肌肉/纤维蛋白发育(Karlsen et al. 2022;Yan et al. 2021) (FERMT2, 0.87倍变化;PDLIM5, 0.94 foldchange)通过每千碱基的外显子模型每百万映射片段(FPKM)进行验证(图3G)。因此,这些结果表明TGF-β1可能在正常FB中赋予侵袭性转录组表型。

为了更精确地注释TGF-β1诱导的生物实体,进行了基因集富集分析(GSEA),结果显示平滑肌收缩和病理肌肉组织发育同样富集(图4A, B)。已建立的MFB标记显著上调(Fortier et al. 2021;Saito et al. 2018;Aschner和Downey 2016),包括ACTA2(0.5倍变化上调),COL1A1(2.55倍变化上调),COL3A1(0.61倍变化上调)和FN1(2.64倍变化上调)在TGF-β1处理的FB中可见,并通过RT-qPCR和Western blot检测验证(图4D-F)。这些发现为TGF-β1在正常FB中启动MFB分化提供了理论依据。它们可以作为进一步研究uMSC对FMT调控作用的模型。

图4
figure 4

与uMSC共培养可抑制TGF-β诱导的mfb特异性标志物的表达。A, B基因集富集分析(GSEA)提示TGF-β1诱导的MFB激活血管平滑肌收缩和肥厚性心肌病功能。在FB、MFB和共培养MFB样品中,MFB标记物包括ACTA2(编码a-SMA)、COL1A1、COL3A1和FN1的C、D RNA-seq基因表达(FPKM)和qPCR验证。E, F FB、MFB和共培养MFB样品中纤维连接蛋白、COL1A1和a-SMA蛋白的Western blot检测。FPKM,每千个碱基的外显子模型片段,每一百万个映射片段。* < 0.05;** p < 0.01;*** p < 0.001

MFB与uMSC短期共培养可可逆地去分化为fb样细胞

为了研究uMSC介导的对促纤维化FMT的潜在调节作用,我们进行了MFB与uMSC的非接触transwell共培养实验。单剂量TGF-β1治疗后,MFB分化具有时间依赖性,可维持2-4天的稳定(Hecker et al. 2011;Vaughan et al. 2000;Thannickal et al. 2003)。为了模拟TGF-β1在IPF/BO中持续升高的微环境,我们在MFB-MSC非接触transwell共培养体系中也维持了10 ng/mL浓度的TGF-β1(图3A)。

采集正常FB (n = 3)、MFB (n = 3)和共培养MFB (n = 3)样品,进行高通量RNA测序(RNA-seq)和功能测定。我们首先使用流式细胞术研究未经治疗的FB、MFB和FB样细胞表面抗原的表达。结果表明,这些FB、MFB和共培养的MFB样品在蛋白质水平上具有相似的间充质相关表面抗原表达(附加文件1:图S1),这与先前的报道(Hajizadeh-Tafti et al. 2022;Lupatov et al. 2015)。由于MSC是一组具有分泌功能的细胞特性,并且与FB和MFB具有共同的间充质起源,因此我们下一步试图研究对共培养MFB的潜在同化作用。在将共培养MFB的转录组与我们之前发表的正常MSCs的数据进行直接比较后(Xu et al. 2021),我们的结果通过确认这些共培养细胞中缺乏msc特异性转录物的表达,排除了潜在的同化效应(附加文件1:图S2)。

接下来,进行无监督主成分分析(PCA)。正如预期的那样,正常FB和MFB之间存在巨大的转录组异质性。有趣的是,与uMSC共培养显著降低了这种转录组异质性。TGF-β1处理在MFB中造成的转录组改变在很大程度上被uMSC挽救,这与未处理的FB样品中观察到的情况相似(图5A)。肌原纤维组装是MFB的一项特征性功能,而在正常FB中,该功能的活性受到抑制(Rodriguez et al. 2019)。由参与肌原纤维组装的45个基因面板的无监督聚类热图显示,在MFB样品中观察到的大多数上调/下调基因在与uMSC共培养后显著获救。这些共培养的MFB细胞优先与FB样本聚集,与正常FB相似(图5B)。然而,我们的进一步分析显示,与未经处理的FB相比,这些FB样细胞在转录组水平上仍表现出一定的差异(附加文件1:图S3)。因此,这些数据揭示了uMSC将TGF-β1诱导的MFB去分化为一组fb样细胞。

图5
figure 5

umsc介导的MFB去分化的细胞特性和可逆性鉴定。对FB, MFB和共培养MFB样本的转录组进行主成分分析(PCA)。B在FB、MFB和共培养MFB样品上参与肌原纤维组装的45个基因面板的无监督聚类热图。C RT-qPCR检测6组细胞中ACTA2(编码a-SMA)、COL1A1、COL3A1和FN1的表达情况:(1)未处理FB;(2)地铁消防队;(3)短期共培养MFB (fb样细胞);(4)长期共培养MFB;(5) TGF-β1处理fb样细胞,不加uMSC喂料层;(6) TGF-β1处理的fb样细胞加uMSC喂料层。D、E Western blot检测6组细胞中FN1、COL1A1和a-SMA蛋白的表达情况:(1)未处理FB;(2)地铁消防队;(3)短期共培养MFB (fb样细胞);(4)长期共培养MFB;(5) TGF-β1处理fb样细胞,不加uMSC喂料层;(6) TGF-β1处理的fb样细胞加uMSC喂料层。F, G通过光镜和CCK-8检测FB、MFB和共培养MFB的增殖情况。H, I凋亡FB, MFB和共培养MFB通过Annexin V/PI检测。* < 0.05;** p < 0.01;*** p < 0.001

接下来,为了研究这种umsc介导的MFB去分化是持久的还是可逆的,使用以下6组设置的细胞对MFB标记进行RT-qPCR和Western blot:(1)未经处理的FB;(2)地铁消防队;(3)短期共培养MFB (fb样细胞);(4)长期共培养MFB;(5) TGF-β1处理fb样细胞,不加uMSC喂料层;(6) TGF-β1处理的fb样细胞加uMSC喂料层。RT-qPCR结果显示,在TGF-β1存在的情况下,与uMSC共培养时,这些fb样细胞中MFB标记物(ACTA2、COL1A1、COL3A1和FN1)的表达显著下调(图5C,第3组)。然而,从uMSC饲养层中退出后,这些去分化的fb样细胞对TGF-β1仍然敏感,并立即被重新诱导为MFB(图5C;a-SMA和COL1A1蛋白的Western blot检测进一步验证了这些MFB标记物的动态变化(图5D, E)。我们还检测了各组fb衍生后代的细胞增殖和凋亡情况。光镜和CCK-8检测显示,与正常FB和MFB组相比,FB样细胞的增殖明显增强(1.87±0.05 vs1.12±0.04,P < 0.001),而MFB组与FB组相比,增殖无明显增加(图5F, G)。各组间细胞凋亡率无显著差异(图5H, I)。

uMSC通过选择性去分化TGF-β1诱导的MFB有效抑制TGF-β-SMAD2/3信号通路

为了进一步阐明MFB中msc介导的去分化的分子转导,我们鉴定了那些选择性靶向转录本,定义为在MFB中显著调控的DEGs (MFB vs. FB),然后在与uMSC共培养后反向调控(FB样细胞vs. MFB)。通常,在MFB中鉴定的2353个DEGs (MFB vs. FB)中,与uMSC共培养后,共有599个DEGs (FB样细胞vs. MFB)被反向调节,因此被认为是uMSC介导的去分化的转录组靶点(图6A)。对这些基因的注释显示了一系列分子功能(MF)的显著富集,包括肌动蛋白结合(GO:0003779)、钙粘蛋白结合(GO:0045296)和SMAD结合(GO:0046332)(图6B,红色)。在功能特征上,fb样细胞的巨噬表达模式(图6C)、对TGF-β1的反应(图6D)、胶原纤维组织(图6E)也受到显著调节。

图6
figure 6

在umsc介导的MFB去分化过程中靶基因的注释。维恩图描绘了在MFB中调控的deg数量(MFB vs. FB),然后在共培养的MFB中反向调控(共培养的MFB vs. MFB)。B利用目标DEGs进行生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞成分(CC)的富集基因本体分析(EGO)。C-E FB、MFB和共培养MFB样品中参与巨噬、对TGF-β1的反应和胶原纤维组织的基因的无监督聚类热图

TGF-β1直接激活Smad信号,如Smad2/3信号,其病理激活与纤维化发生相关(Hu et al. 2018)。对前3个富集MF术语的网络分析证实了SMAD结合功能的显著富集,并指出了一系列相关的deg(图7A)。大多数涉及smad的deg在MFB中被证实显著上调,然后在与uMSC共培养后获救(图7B)。通过对每个基因的术语和折叠变化进行更综合的分析,GSEA分析证实TGF-β1处理激活了广泛的SMAD信号以及mfb相关功能(图7C)。继uMSC靶向基因的功能注释结果之后,GSEA还揭示了uMSC挽救了大部分SMAD信号功能,其中SMAD2/3信号主要下调(图7D)。这些数据证明,在去分化过程中,umsc介导的MFB去分化是通过选择性调节MFB内TGF-β-SMAD2/3信号传导进行的。

图7
figure 7

TGF-β-SMAD2/3信号通路在umsc介导的MFB去分化中的可逆调节。肌动蛋白结合、钙粘蛋白结合、SMAD结合和相关deg的网络图示。B FB、MFB和共培养MFB样本中参与SMAD结合的基因的无监督聚类热图。MFB中调控基因的GSEA分析(MFB vs. FB)。共培养MFB中调控基因的GSEA分析(共培养MFB vs. MFB)。E RT-qPCR检测6组细胞中TGFB1、TGFBR1、SMAD2和SMAD3的表达情况:(1)未处理FB;(2)地铁消防队;(3)短期共培养MFB (fb样细胞);(4)长期共培养MFB;(5) TGF-β1处理fb样细胞,不加uMSC喂料层;(6) TGF-β1处理的fb样细胞加uMSC喂料层

为了进一步验证这种umsc介导的调控,我们对来自每个培养组的fb衍生后代进行了TGF-β-SMAD2/3信号传导核心转导的RT-qPCR检测。根据这些MFB特异性标志物在培养过程中的动态变化(图5C), RT-qPCR检测结果证实,与FB相比,TGF-β-SMAD2/3转导因子(TGFB1、TGFBR1、SMAD2和SMAD3)在MFB中的表达显著上调,而这些转导因子在去分化的FB样细胞中表达显著下调(图7E)。与uMSC短期和长期共培养导致TGF-β1诱导的TGF-β-SMAD2/3转录本表达持续抑制(图7E,第3组和第4组)。重要的是,MFB中TGF-β-SMAD2/3通路的激活状态也注意到可塑性。退出uMSC饲养层后,这些TGF-β-SMAD2/3转录本的表达再次升高(图7E,第5组)。最后,通过将TGF-β-SMAD2/3转录本的动态整合到京都基因与基因组图谱(KEGG)中,揭示了TGF-β-SMAD2/3信号在uMSC介导的MFB去分化过程中的详细修饰(图8A)。总之,RNA-seq和体外实验的结果表明,uMSC细胞通过调节TGF-β-SMAD2/3通路,可逆地将TGF-β1诱导的MFB分化为一组fb样细胞,并在这些细胞中看到增殖增强。这些细胞在转录组水平上与FBs非常相似,但表现出独特的表面抗原表达和功能特征(附加文件1:图S3)。这些fb样细胞仍然对TGF-β1敏感,并且在退出uMSC喂料层后可以立即重新诱导为MFB(图8B)。

图8
figure 8

TGF-β-SMAD2/3信号的选择性调控。A根据KEGG数据库,TGF-β-SMAD2/3信号通路转录本调控。B uMSC通过调节TGF-β-SMAD2/3通路,将TGF-β1诱导的MFB可逆地分化为一组fb样细胞

讨论

FMT的开始和MFB的过度积累被认为是小气道纤维化发展过程中的关键病理事件(Bergeron et al. 2013;Neuringer et al. 1998;Kelly et al. 2012;Yang et al. 2020)。在离体状态下,在缺乏促纤维化细胞因子的情况下,MFB的功能表型不能长期维持(Kuhn and McDonald 1991)。因此,缺乏能够模拟局部肺微环境的模型在很大程度上阻碍了病理条件下FMT的揭示。在本研究的第一部分中,我们以IPF为范式来研究FMT过程中的分子/功能实体。TGF-β1及其下游通路的高血压被认为是肺纤维化的标志(Saito et al. 2018)。随着肌肉组织形成的激活,我们对GEO数据集的生物信息学分析证实了这些患者来源的FB样本中对TGF-β1的响应的显著特征。根据之前的观察,我们的数据证实,TGF-β1在正常FB上的作用很容易从转录和功能水平启动促纤维化FMT。这些发现为TGF-β1体外模拟FMT提供了理论依据,为进一步研究uMSC对FMT的调控提供了理论依据。

根据已发表的文献,对MFB的潜在调节作用更可能依赖于一系列MFB衍生的可溶性因子的分泌以及随后MFB内部的下游信号转导。这些确定的可溶性因子在不同的研究中有很大的不同,包括条件培养基(Filidou et al. 2022;Zhang et al. 2015)、外泌体(Hu et al. 2020)和microRNA谱(Qiu et al. 2022;Basalova et al. 2020;Fang et al. 2016)(附加文件1:表S3)。通过构建模拟纤维化疾病的体内和体外模型,这些msc衍生因子在动物模型中被发现可以阻断/逆转MFB分化和/或减轻纤维化表型。结合这些观察结果,我们的TGF-β1诱导的FMT模型和非接触式uMSC共培养模型证实,uMSCs逆转TGF-β1诱导的MFB标记的表达,下调MFB相关功能,从而支持uMSC潜在的去分化作用。由于现有研究的主要目的是探索核心转导器并揭示uMSCs介导的MFB去分化的可逆性,因此我们没有探索uMSCs的分泌特性。

鉴于FB、MFB和MSC具有共同的间充质起源,我们接下来通过确认这些FB样细胞中缺乏MSC特异性转录物来排除潜在同化效应的可能性(附加文件1:图S2)。然而,我们的进一步分析显示,与未经处理的FB相比,这些FB样细胞在转录组水平上仍表现出一定的差异(附加文件1:图S3)。因此,这些数据揭示了uMSC将TGF-β1诱导的MFB去分化为一组fb样细胞。

最近的研究表明,在某些情况下,MSC也可能作为局部纤维化的潜在促进因子(Qin et al. 2023)。MSC对纤维化的这种双重调节可能归因于MSC对促炎(高TNF-a, IL-1b)和氧化(高ROS)局部环境的潜在“驯化”作用,这在IPF和BO组织中得到了很好的表征(Wang and Yang 2022)。暴露于促炎细胞因子(如TNF-a、IL-1b和IL-6)和活性氧(ROS)可能诱导MSCs的衰老相关分泌表型(SASP)和衰老(Wallace and Friedman 2014;Shenderov et al. 2021;Yao et al. 2020),从而促进它们进入促纤维化表型,促纤维化细胞因子分泌增加。我们对MSCs分泌功能的进一步分析(Rubinstein-Achiasaf et al. 2021)进一步证实,暴露于促炎微环境容易诱导SASP,并上调促纤维化细胞因子的表达,包括IL-6、IL-7、IL-1A和FGF2(附加文件1:图S4)。与这些观察结果相结合,尽管我们目前的研究证实了uMSCs可以在体外抑制MFB表型并将其去分化为fb样细胞,但现有的数据也强调了同种异体MSCs潜在的促纤维化特性。通过对去分化fb样细胞增殖的显著促进,我们有理由推测,同种异体间充质干细胞的引入会扩增TGF-β1敏感的fb样细胞,在TGF-β1丰富的微环境下,这可能是促纤维化MFB的“车间”。这些数据也可能解释了同种异体间充质干细胞治疗在动物模型和BO患者中的非持久疗效(Wan et al. 2020;Wu et al. 2015;Ni et al. 2018)。然而,同种异体间充质干细胞对宿主微环境的反应性,以及由此产生的MFB去分化的持久性,在很大程度上仍未被探索。

尽管参与MFB调控的msc相关分泌因子(如多种mirna)谱变化极大,但MFB去分化过程中的下游信号转导仍未确定。提出的调控途径包括TGF-β-SMAD2/3信号(Hu et al. 2020;Fang et al. 2016;Wang 2023), WNT/b-catenin信号传导(Zhang et al. 2015), PI3K/Akt, MAPK信号传导(Li et al. 2020)和PD-1/PD-L1信号传导(Ni et al. 2018)。通过多维转录组分析,我们目前的研究结果表明,MFB分化的启动和umsc介导的去分化都与TGF-β-SMAD2/3信号的激活/抑制显著相关。TGF-β1处理TGF-β-SMAD2/3信号通路中TGF-β-SMAD2/3诱导的转导因子(TGF-β1、TGFBR1、SMAD2/3)在与uMSC共培养后大部分被挽救。然而,典型/非典型WNT信号在这些调控中并不重要。这些观察结果与Hu et al.(2020)先前的报告一致,该报告揭示了通过抑制TGF-β-SMAD2/3信号显著抑制FMT。

虽然我们目前的数据和之前的报告已经表明MSC细胞具有阻断和调节病理FMT过程的能力,但它们对微环境应激的易感性是治疗BO和其他纤维化疾病的主要障碍(Gao et al. 2022)。我们证明了msc介导的MFB去分化的可逆性和去分化fb样细胞的敏感性,这可能部分解释了在肺纤维化疾病模型中msc相关疗效的短暂持续时间。然而,我们目前的研究还存在一定的缺陷。由于现有研究的主要目的是探索核心转导器并揭示uMSCs介导的MFB去分化的可逆性,因此我们没有探索uMSCs的分泌特性。鉴定功能性外泌体特性(如microRNA、lncRNA)有助于开发基于msc的无细胞疗法,这可能会通过促纤维化微环境克服这种驯化效应(Hu et al. 2020)。另一方面,靶向促纤维化微环境在治疗已建立的纤维化方面可能具有很大的治疗价值。

结论

总之,我们的研究结果首次报道了umsc通过选择性抑制TGF-β-SMAD2/3信号通路介导的MFB向fb样细胞去分化的可逆性。这些增殖增强的fb样细胞对TGF-β1仍然敏感,可以被重新诱导成MFB。MFB的可逆性去分化可以解释MSC在治疗BO和其他纤维化疾病的临床疗效不一致的原因。我们的工作进一步强调了纠正促纤维化微环境的重要性。应充分考虑TGF-β1敏感fb样细胞增加的潜在风险。

补充信息

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附加文件1:图S1。流式细胞术检测表面抗原CD105、CD73、CD90、CD45、CD34和HLA-DR的表达。图S2。正常骨髓MSC、未处理FB、MFB和FB样细胞中MSC特异性标记物和转录物的比较分析。使用SVA方法对潜在批效应进行归一化。正常骨髓间充质干细胞、未处理的FB、MFB和FB样细胞中MSC特异性表面抗原mRNA表达的归一化。正常骨髓间充质干细胞、未处理的FB、MFB和FB样细胞中成骨转录物mRNA表达的正常化。正常骨髓间充质干细胞、未处理的FB、MFB和FB样细胞中分泌造血支持因子的mRNA表达正常化。图S3。FB样细胞与未处理FB之间转录组特征的差异分析。火山图显示FB样细胞中鉴定的DEGs,与未处理的FB进行了log2倍的变化和调整的p值。共鉴定出840个deg。FB样细胞和未处理FB中21个FB/ mfb相关特征转录物转录组水平的无监督聚类热图。ACTA2, COL1A1, COL3A1和FN1在FB样细胞和未处理FB中的表达验证。基于显著上调degin和显著下调degin fb样细胞的KEGG注释。基于全转录组的GSEA分析揭示了fb样细胞中TGF-β1信号通路被抑制的特征。图S4。在正常间充质干细胞中,暴露于促炎细胞因子诱导SASP和促纤维化细胞因子的上调表达。在进行rna测序之前,对正常骨髓间充质干细胞进行短期/长期培养,分别添加或不添加促炎细胞因子。30种sasp相关细胞因子转录组水平的无监督聚类热图,分别为长期培养未处理的MSC、长期培养处理的MSC、短期培养未处理的MSC和短期培养处理的MSC。各培养环境中MSCs促纤维化细胞因子mRNA表达的归一化。表S1。包括在线数据集的详细信息。表S2。RT-qPCR检测的引物和探针序列。表S3。关于msc介导的MFB调控的现有报道。



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