2023-10-19 06:30

佛得角群岛蚊虫(双翅目:库蚊科)自然沃尔巴克氏体感染的筛查

摘要

背景

沃尔巴克氏体(Wolbachia pipientis)是一种内共生细菌,在蚊子体内诱导细胞质不相容并抑制虫媒病毒复制。本研究旨在评估佛得角不同蚊种沃尔巴克氏体的流行情况和遗传多样性。

方法

在佛得角6个岛屿采集蚊虫,利用形态键和pcr方法鉴定蚊虫种类。通过扩增表面蛋白基因(wsp)片段检测沃尔巴克氏体。采用coxA、gab、ftsZ、hcpA和fbpA 5个管家基因和wsp高变区(HVR)进行多位点序列分型(MLST)。采用锚蛋白结构域基因pk1的pcr -限制性片段长度多态性(RFLP)方法鉴定wPip组(wPip- i至wPip- v)。

结果

共采集蚊虫9种,主要媒介为埃及伊蚊、阿拉伯按蚊、严格感库蚊和致倦库蚊。沃尔巴克氏体仅在Cx中检出。库蚊(100%流行);致倦库蚊(98.3%);致倦库蚊/致倦库蚊杂交(100%)和三角库蚊(100%)。根据MLST和wsp高变区分型结果,沃尔巴克氏体来自Cx。经PCR/RFLP分析,在佛得角发现3个wPip类群,分别为wPip- ii、wPip- iii和wPip- iv。wPip-IV型最常见,而wPip-II型和wPip-III型仅在Maio岛和Fogo岛发现。在Cx检测到沃尔巴克氏体。tigripes属超群B,无MLST特征,提示该蚊属沃尔巴克氏体新菌株。

结论

沃尔巴克氏体在中国的物种中具有较高的流行率和多样性。侵害复杂。这种多样性可能与蚊子在佛得角群岛的殖民历史有关。据我们所知,这是第一次在Cx中检测到沃尔巴克氏体。Tigripes,这可能为生物防治倡议提供额外的机会。

图形抽象

背景

沃尔巴克氏体(α变形菌属,立克次体)是一种细胞内的特异性革兰氏阴性细菌和变形菌共生体,存在于多种无脊椎动物中,包括昆虫、甲壳类动物、蛛形纲动物和丝状线虫。目前,沃尔巴克氏菌属被细分为17个超群(A-F;H-Q和S),大多数已知的物种属于A和B超群。

沃尔巴克氏体通过宿主卵垂直传播,可影响寿命和生殖,包括雌性化、孤雌生殖和雌雄生殖细胞不相容。沃尔巴克氏体在节肢动物中引起的最著名的表型是细胞质不相容(CI)。当携带沃尔巴克氏体的雄性与未感染的雌性杂交或在感染不相容菌株的个体之间杂交时,就会发生这种情况[4,5]。普遍接受的模型规定细胞质不相容性是由沃尔巴克氏体“修饰”因子(mod;毒素)在精子中阻碍早期胚胎发生,沃尔巴克氏体“拯救”因子(resc;抗毒素)在卵母细胞中产生,如果杂交是相容的,它允许二倍体受精卵发育[6,7]。

除了细胞质不相容外,沃尔巴克氏体还能抑制蚊子体内的病毒复制,包括埃及伊蚊体内的寨卡病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒和基孔肯雅虫媒病毒[8,9]。其他研究也提示抑制病原体,如在斯氏按蚊和冈比亚按蚊中抑制恶性疟原虫,在致倦库蚊中抑制西尼罗河病毒[1,10,11]。这些能力使沃尔巴克氏体成为对抗蚊媒疾病的有希望的工具,并可能成为使用杀虫剂的传统媒介控制计划的替代方案。事实上,将携带不相容沃尔巴克氏体的雄性释放到目标种群中,通过绝育成功地减少了繁殖[12,13]。Ae的释放。埃及伊蚊转染沃尔巴克氏体wMel菌株(源自黑腹果蝇)导致伊蚊的建立。感染沃尔巴克氏体的埃及伊蚊种群和已证实的澳大利亚b1和马来西亚b1登革热发病率下降。

佛得角受到几种病媒蚊子的威胁,包括伊蚊。埃及伊蚊、阿拉伯按蚊;致倦库蚊、严感库蚊等。病媒综合控制策略主要针对蝇类。arabiensis和Ae。埃及伊蚊,使用化学杀虫剂、柴油和生物防治,以甘布西亚鱼[17]。然而,尽管采取了控制措施,该国在2009年发生了第一次登革热疫情,随后在2015-2016年爆发了寨卡病毒,并在2017年爆发了疟疾。

没有关于佛得角群岛感染沃尔巴克氏体的蚊子(双翅目:库蚊科)遗传多样性的数据。这一知识将是设计和实施通过细胞质不相容抑制蚊子种群的计划的第一步。在此背景下,本研究旨在检测佛得角库蚊科种群中的沃尔巴克氏体并对其进行遗传表征。

方法

研究区域和样本收集

2021年2月至6月期间在佛得角进行了昆虫学调查。在Santiago、Brava、Fogo、Maio、Santo ant 和Boavista 6个岛屿采集成蚊和幼虫样本;图1)使用BG-Sentinel和美国疾病控制与预防中心(CDC)的诱光器、背吸器、吸管和移液器。使用便携式全球定位系统(GPS)设备(Garmin eTrex 10)对所有采集点进行地理参考。

图1
figure 1

北大西洋地区地图,显示佛得角群岛的地理位置。在圣安塔<e:1>岛、博阿维斯塔岛、马约岛、圣地亚哥岛、福戈岛和布拉瓦岛(以黑色突出显示)收集了蚊子样本。

使用Ribeiro等人的[20]鉴定密钥对蚊子进行种/复合鉴定,并将其单独储存在含有硅胶(成虫)或80%乙醇(幼虫)的微管中。根据Weeks等人的研究,在基因分析中,使用2%的西曲溴铵(CTAB)和蛋白酶K从单个标本中提取DNA。

安的种类。根据Scott et al.[22]使用引物序列如表S1所示,采用聚合酶链反应(PCR)鉴定gambiae复合体(附加文件1:表S1)。PCR采用12.5µl Xpert TaqPLUS Mastermix (GriSP), 0.1µM ME和UN引物,0.05µM GA引物,0.15µM AR引物,加1µl DNA模板和水至终体积为25µl。循环条件为:95℃1次循环5 min, 94℃30 s, 50℃30 s, 72℃30 s;最后在72°C下循环5分钟。

对于Cx。使用Smith & Fonseca[23]描述的引物对乙酰胆碱酯酶-2 (ace-2)基因序列进行PCR扩增,鉴定标本为种(附加文件1:表S1)。PCR采用12.5µl Xpert TaqPLUS Mastermix (GriSP), 0.4µM ACEquin和B1246引物,0.2µM ACEpip引物,1µl DNA模板和水,最终体积为25µl。循环条件如下:94℃1次循环5分钟,94℃35次循环30秒,55℃30秒,72℃1分钟,72℃1次循环5分钟。

必要时,根据Folmer et al.[24],利用引物LCOI1490_F1和HCOI2198_R1对细胞色素c氧化酶线粒体基因1亚基(COI)的710碱基对(bp)片段进行测序(附加文件1:表S1),支持上述物种以外的形态鉴定。PCR使用1X PCR缓冲液,2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 1 U Taq聚合酶(Robust HotStart PCR Kit, Roche/Kapa Biosystems),每种引物0.5µM, DNA模板2µl,水至最终体积20µl。循环条件为:94℃初始变性3min;在94℃下循环40次,持续50秒;45℃退火30 s, 72℃退火1 min;在72°C下延长5分钟。

筛选沃尔巴克氏体属

利用Zhou等人描述的引物81F和691R扩增沃尔巴克氏体表面蛋白基因(wsp) 610 bp区域(附加文件1:表S2),对蚊虫样本进行沃尔巴克氏体检测。扩增反应包括12.5µl Xpert TaqPLUS Mastermix (GriSP),每种引物0.4µM, DNA模板1µl,水至最终体积为25µl。循环条件为:95℃1次循环3分钟,95℃1分钟35次循环,55℃1分钟,72℃1分钟,72℃1次循环10分钟。

以上所有PCR产物均在GreenSafe Premium (NZYTech)染色的1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。

沃尔巴克氏体属多位点序列分型(MLST)wsp打字

通过对5个MLST位点(gatB、coxA、hcpA、ftsZ、fbpA)和wsp高变区进行扩增和测序,进行沃尔巴克氏体基因分型[26,27]。每个基因座的引物对和扩增产物的大小见补充材料(附加文件1:表S3)。

每个位点的PCR使用1X PCR缓冲液,0.2 mM dNTPs, 1.5 mM MgCl2, 0.5U Taq聚合酶(Robust HotStart PCR Kit, Roche/Kapa Biosystems),每个引物1µM, DNA模板2µl,水至最终体积为40µl。循环条件为:94℃初始变性2min;37次循环,94°C 30 s, 54°C (hcpA, gatB, ftsZ,和coxA)退火,59°C (fbpA和wsp) 45 s, 72°C 90 s;72℃下10min的最终伸长率。

每个位点取5微升PCR产物进行电泳确认扩增。剩余的35µl使用Exo/SAP Go PCR纯化试剂盒(GriSP)纯化,并送到STAB Vida (Oeiras, Portugal)使用正向和反向引物进行直接DNA测序。

使用BioEdit (version 7.0.9.0)对Wolbachia MLST和高变量wsp序列进行编辑和比对。在Wolbachia MLST数据库(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_wolbachia_seqdef)中查询一致序列和串联序列(gatB、coxA、fbpA、ftsZ、hcpA和wsp高变区[HVR])进行菌株表征。序列还经过核苷酸基本局部比对搜索工具(BLAST)验证与存放在GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的序列的相似性。

采用gamma-distributed Tamura 3-parameter nucleotide substitution模型进行系统发育分析,并在Molecular Evolutionary Genetics analysis version 11 (MEGA11)[28]中使用1000个bootstrap生成邻居连接树。

的识别wPCR-RFLP分组

基于锚蛋白(ANK)沃尔巴克氏体标记物pk1,采用pcr -限制性片段长度多态性(RFLP)方法鉴定wPip组(wPip- i至wPip- v)[29,30,31]。用引物pk1_For和pk1_Rev(附加文件1:表S2)[32]进行了ANK结构域基因(pk1) 1300 bp片段的PCR扩增。反应组分为:Xpert TaqPLUS Mastermix (GriSP) 10µl,每种引物0.4µM, DNA模板2µl,水至终体积20µl。循环条件为:94℃,1次循环5 min;35次循环,94°C 30秒,52°C 30秒,72°C 90秒;最后循环72°C, 5 min。PCR产物在GreenSafe Premium (NZYTech)染色的2%琼脂糖凝胶上电泳分析。

用限制性内切酶TaqαI和PstI对pk1 PCR产物进行酶切,鉴定不同的wPip基团[29]。TaqαI酶切采用以下反应混合物:2µl Buffer C (NZYTech), 10µl PCR产物,18µl水,2µl TaqαI酶(NZYTech),浓度为10U/µl。将混合物置于65℃的热循环器中90 min,每管加入0.02 mM的乙二胺四乙酸(EDTA) (pH = 8)停止反应,在2%琼脂糖凝胶上电泳观察消化产物。每个等位基因(wPip组)根据所得到片段的大小进行检测:等位基因“a”或“e”(wPip- i或wPip- v;991, 251, 107 bp);“b”(wPip-III;669, 665 bp);“c”(wPip-II;851, 498 bp);“d”(wPip-IV;497, 251, 107 bp)[29]。

如果存在等位基因“a”或“e”(wPip-I或wPip-V),则用PstI限制性内切酶消化pk1 PCR产物来区分两者。为此,用2µl Buffer a (NZYTech)、12µl pk1 PCR产物、1µl PstI酶(NZYTech) (10U/µl)和5µl水配制反应混合物。37℃孵育1 h, 80℃孵育20 min停止反应。酶切DNA片段在2%琼脂糖凝胶上电泳分离。由pstI消化产生的wPip等位基因包括“a”(wPip- I;903, 303, 141 bp)和“e”(wPip-V;903,430 bp)[29,30]。

对pk1 PCR产物进行测序以确认RFLP谱。为此,pk1 PCR产物按照上述方法纯化,用于MLST,并使用反向和正向引物进行直接测序。对序列进行核苷酸BLAST分析,采用gamma-distributed Tamura 3参数核苷酸替代模型进行系统发育分析,并在MEGA软件11.0.11版本中使用1000次bootstrap生成邻居连接树。


目录


摘要
背景
方法
结果
讨论
结论
数据和材料的可用性
缩写
参考文献
致谢

作者信息
道德声明

补充信息



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结果

蚊种鉴定

共捕获蚊虫1648只,其中幼虫303只,成蚊1345只(详见表S4)。形态特征鉴定表明该蚊属存在。蚊(n = 663, 40.2%)、伊蚊caspius (n = 39岁,2.4%)。冈比亚蚊(n = 49, 3.0%),比勒托按蚊(n = 275, 16.7%);库蚊(584只,占35.4%)、thalassi库蚊(7只,占0.4%)、tigriticus(3只,占0.2%)、longiareolata库蚊(28只,占1.7%)。

核糖体DNA聚合酶链反应(PCR)鉴定安属虫种。冈比亚复合体显示,该复合体采集的标本均属于冈比亚复合体。arabiensis。对于Cx。经ace-2 PCR鉴定为Cx。(n = 10, 1.7%);致倦库蚊(n = 545, 93.3%);侵害/残雪。致倦库蚊杂交种29只,占5.0%。

筛选沃尔巴克氏体属

wsp片段仅在Cx中扩增。库蚊(10/10 = 100%);致倦库蚊(536/545 = 98.3%);侵害/残雪。致倦库蚊杂交种(29/29 = 100%);Tigripes(3/3 = 100%)。其余物种沃尔巴克氏体呈阴性。

沃尔巴克氏体属MLST和wsp打字

我们分析了80只wsp阳性的沃尔巴克氏体MLST和wsp分型。由MLST位点和wsp高变区测序得到的等位基因图谱显示,来自Cx的沃尔巴克氏体。[3];致倦库蚊和Cx。侵害/残雪。致库蚊杂种属于序列型9、wPip支系和超B群沃尔巴克氏体(表1)。利用MLST位点(coxA、gatB、ftsZ、fbpA、hcpA)和wsp高变区(图2)的串联序列进行系统发育分析得到了相同的结果。

表1 MLST基因和wsp佛得角群岛不同库蚊种的高变异区
图2
figure 2

由MLST位点(coxA, gatB, ftsZ, fbpA, hcpA)和wsp高变区串联序列生成的系统发育树。分支上的数字表示百分比引导支持(1000个复制)。参考序列从沃尔巴克氏体MLST数据库中获取,并用圆标记。每个沃尔巴克氏体超群用不同的颜色标记:黄色,超群B;黑色,超群A;红色,超群D;绿色为超群f,刻度条表示取代数

残雪。然而,获得的等位基因图谱在MLST数据库中是不可用的,因此无法确定序列类型。然而,系统发育分析表明来自Cx的沃尔巴克氏体。tigripes也属于超群B,但与wPip整合了一个不同的分支(图2)。

wPip群及其在群岛上的分布

pk1 PCR-RFLP结果显示,佛得角存在三种不同的wPip组,分别为wPip- iv(88.9%)、wPip- ii(7.4%)和wPip- iii(3.7%)(表2)。来自五个岛屿(圣地亚哥、布拉瓦、圣安特 奥、马约和博阿维斯塔)和Cx的致倦库蚊。来自圣安托 的pipiens s.s.。wPip-II组仅在Cx中检测到。而wPip-III仅在Cx中发现。致倦库蚊和Cx。福戈岛的致倦库蚊/致倦库蚊杂交体(表2)。

表2w检测到的Pip组残雪。侵害从佛得角群岛pk1 PCR–RFLP

pk1 PCR产物的测序证实了观察到的RFLP谱图以及与存放在GenBank中的pk1序列的相似性(图3)。

图3
figure 3

由pk1序列经贝叶斯分析生成的系统发育树。已知的wPip群pk1序列用圆标记。分支上的数字表示百分比引导支持(1000个复制)。比例尺表示替换的次数

讨论

沃尔巴克氏体因其控制蚊虫传播疾病的能力而受到广泛关注。这项研究首次评估了沃尔巴克氏体在佛得角蚊子中的流行程度和遗传多样性。我们的目标是通过我们的发现扩大对这种细菌的认识,并说明它在控制群岛蚊媒疾病方面的潜力。

MLST和wsp分型结果显示来自Cx的沃尔巴克氏体。库蚊和Cx。致倦库蚊及其杂种属于wPip分支,在沃尔巴克氏体b类群中具有单系起源。Atyame et al.[33]和Dumas et al.[30]在研究Cx沃尔巴克氏体遗传多样性时也得到了相同的结果。来自世界不同地区的库蚊种群。根据作者的说法,这些发现表明wPip菌株包括沃尔巴克氏体超群B的一个最新分支[30,33]。

对快速进化的pk1基因的分析揭示了wPip菌株内部的进一步变异,表明在佛得角存在wPip- ii、wPip- iii和wPip- iv群。不同wPip群体的出现表明有多次引入群岛的事件。在过去,佛得角是欧洲和非洲大陆之间的海上枢纽,船只的频繁移动可能解释了岛上发现的wPip的多样性。这一结果与西南印度洋岛屿的结果形成对比,在那里沃尔巴克氏体感染了Cx。致倦库蚊均属于wPip-I类群[13]。值得注意的是,wpip - 1是唯一在撒哈拉以南非洲大陆、南美洲和东南亚发现的群体,而仅在北美发现了wPip-III[30,33]。欧洲显示出最高的多样性,在这个大陆上发现了所有五个wPip分支。wPip-II、wPip-III和wPip-IV群在佛得角群岛的存在表明沃尔巴克氏体至少有三次传入事件,可能起源于欧洲。然而,不能排除福戈岛wPip-III群的北美起源。有趣的是,在岛屿之间发现的wPip进化支的遗传组成差异与Cx的遗传结构一致。佛得角的库蚊群。先前基于微卫星的分析表明,Cx。福戈岛的致倦库蚊可能包括一个与其他岛屿不同的遗传祖先群。以前被认为是混合的Cx。Fogo岛bbb10的致倦库蚊种群实际上可能代表了源自wPip-III类群源种群的遗传分化种群。

非洲wPip-I组在佛得角缺席。致倦库蚊不容易解释。非洲大陆将是wpip - 1 Cx源种群的自然候选者。致倦库蚊可能已经在佛得角群岛定居,就像印度洋西南部岛屿b[30]一样。然而,残雪。致倦库蚊以wPip-IV组感染为主。这一结果可能提示Cx。来自佛得角的致倦库蚊可能来自非洲大陆一个尚未采样的wPip-IV种群。另一种解释可能涉及来自欧洲Cx的wPip-IV的细胞质转移。致wPip-I Cx。致倦库蚊通过杂交,然后后者通过细胞质不相容(CI)进行替换。据报道,在wPip-II和wPip-IV之间以及wPip-III和wPip-IV感染的蚊子之间存在高水平的CI[7,29]。需要进行涉及实验杂交的研究,以评估wPip-I和wPip-IV之间的CI,以及这种CI是否会给感染wPip-IV的蚊子带来适应优势。

未检出沃尔巴克氏体;这与对该物种的大多数调查结果一致,在这些调查中没有发现沃尔巴克氏体自然感染的证据[35,36,37,38]。沃尔巴克氏体的存在。埃及伊蚊仅在少数情况下被报道,包括来自美国新墨西哥州[40]和马来西亚吉隆坡[40]。然而,在伊蚊中检出沃尔巴克氏体的可能性不大。不能排除埃及伊蚊是携带沃尔巴克氏体的线虫感染或野外采集过程中环境污染的结果。在安省也未检出沃尔巴克氏体。arabiensis和An。来自佛得角的比勒陀利亚人。虽然这一结果与大多数在按蚊物种中筛选沃尔巴克氏体的研究一致[41,42],但也有一些关于在安氏按蚊物种中存在沃尔巴克氏体的报道。冈比亚和安哥拉。来自马里的coluzzi。来自刚果民主共和国的冈比亚;coluzzii在加纳,[44]。Shaw等人得出结论,沃尔巴克氏体天然按蚊感染不会引起细胞质不相容或性别比例扭曲,但与疟原虫感染呈负相关,表明沃尔巴克氏体可能干扰疟疾传播。

本研究首次报道了沃尔巴克氏体在中国的存在。tigripes。系统发育分析表明,该蚊分离的沃尔巴克氏体属超B群,无MLST特征。这一结果表明存在一种新的沃尔巴克氏菌感染Cx。圣地亚哥岛的tigripes。tigripes库蚊是佛得角唯一的掠食性蚊子,在圣地亚哥岛,其幼虫经常出现在与Cx有关的繁殖地。库蚊属;我们的结果排除了Cx对环境的污染。沃尔巴克氏体,在其幼虫和成年雄蚊中均检出。tigripes(附加文件2:表S4)。更重要的是,MLST位点与wsp HVR区域的串联序列清楚地表明Cx中检测到的菌株。tigripes形成了一个与wPip分支分离的单系群。我们的系统发育分析还排除了通常在线虫中发现的超群D和F中的沃尔巴克氏体污染[2,48]。

在病媒管理中使用基于沃尔巴克氏体的方法具有重要的前景。新检出的沃尔巴克氏体菌株。佛得角的tigripes鼓励进一步研究,以评估它们在主要媒介跨感染系中牢固建立、诱导细胞质不相容或降低传播病原体能力的能力。这些能力的证明可能为生物防治倡议提供额外的机会。

不亲和昆虫技术(IIT)是不育昆虫技术(SIT)的一种变体,可以利用wpip诱导的细胞质不亲和性来进行。研究表明,Cx。感染相同沃尔巴克氏体wPip群的库蚊往往表现出细胞质相容性,而携带不同wPip群的蚊子之间的杂交往往不相容[13,31]。因此,我们关于wPip群体在佛得角自然发生的研究结果可以为实施Cx控制计划提供有价值的见解。群岛上的冷库蚊。

在半田条件下进行的试验表明,当地的Cx与La r union之间的交配。携带wpip - 1型的致倦库蚊雌蚊和携带wpip - 4型(伊斯坦布尔株)的非本地雄蚊胚胎死亡率均为100%。Altinli等人证实,在中国,携带wpip - iv的雄性与携带wPip-I或wpip - ii的雌性之间自然存在CI模式。土耳其的库蚊种群。这些观察结果表明,基于wpip诱导IC的IIT可以用于控制Cx。侵害人群。考虑到我们收集的关于群岛中wPip群体的流行和分布的数据,同样的方法可以在佛得角实施。分析佛得角不同wPip类群之间的细胞质不相容模式,并确定是否可以使用岛屿特异性wPip类群来调节Cx,是值得研究的。另一个岛上的库蚊种群。作为一种选择,男性Cx。来自世界其他地区的携带wPip群的库蚊可能会被引入佛得角群岛,使当地雌性绝育。值得注意的是,基于wpip诱导IC的IIT可能是昂贵的辐射和基因操作方法的有利替代方案,其实施将为低收入国家提供更有利的解决方案。

结论

我们的研究表明沃尔巴克氏体在Cx广泛存在。孳生于佛得角群岛的淡蚊,但除Cx外,其他蚊种均无。在那里发现了一种新的沃尔巴克氏菌菌株。。在Cx中循环的三个不同的wPip组。库蚊(pipiens s.l.)表明在群岛中有多次引入事件,可能是非非洲起源的。一种新的沃尔巴克氏菌菌株的发现。Tigripes可能为生物防治方法提供了额外的候选物。需要进一步的研究分离这种新的沃尔巴克氏体菌株,用于主要蚊子载体的转染研究,以评估其对蚊子适应性和媒介能力的潜在影响。

补充信息

Additional文件1:表S1。

用于佛得角群岛蚊种分子鉴定的引物序列。表S2。引物用于沃尔巴克氏体的PCR检测和wPip I-V组的PCR- rflp分型。表S3。引物用于沃尔巴克氏体MLST位点和wsp高变区扩增和序列分析。

Additio文件2:表S4

. 在每个岛屿收集蚊子种类,并使用wsp检测沃尔巴克氏体。



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