2023-10-19 06:00

不同达菲血型基因型患者间日疟原虫配子细胞对阿拉伯按蚊的差异传播率

摘要

背景

测量疟疾传播的风险是复杂的,特别是在间日疟原虫的情况下。在间日疟原虫流行的地区,采用膜饲养法可以克服这一问题。然而,蚊食测定法受到许多人、寄生虫和蚊子因素的影响。在这里,本研究确定了间日疟原虫感染患者达菲血型状态的贡献,作为寄生虫传播给蚊子的风险。

方法

对2019年10月至2021年1月在埃塞俄比亚奥罗米亚州东谢瓦区阿达马市及其周边地区方便招募的44例间日疟原虫感染患者进行了膜喂养试验。测定在安道麦市进行。在感染后7 ~ 8天通过中肠解剖测定蚊虫感染率。对44例间日疟原虫感染患者进行Duffy基因分型。

结果

按蚊感染率为32.6%(296/907),感染参与者占77.3%(34/44)。纯合子达菲阳性血型(TCT/TCT)对按蚊的传染性明显高于杂合子达菲阳性血型(TCT/CCT),但差异无统计学意义。以FY*B/FY*BES基因型为食的蚊子平均卵囊密度显著高于其他基因型(P = 0.001)。

结论

间日疟配子体对按蚊的传播性差异可能与达菲抗原多态性有关,但还需进一步研究。

背景

疟疾仍然是影响人类的最具破坏性的寄生虫病之一,对全球公共卫生和经济产生重大影响。据世界卫生组织(世卫组织)估计,2021年有2.47亿例病例,61.9万人死亡。该病由四种不同的人类疟疾致病种(恶性疟原虫、间日疟原虫、疟疾疟原虫和卵形疟原虫)引起,间日疟原虫分布最广,超出了恶性疟原虫的范围。在间日疟原虫和恶性疟原虫共存的流行区,间日疟原虫仍然是疟疾的主要病因,因为它的发病率下降速度比恶性疟原虫慢。间日疟原虫导致严重和致命的后果,这扭转了间日疟原虫感染良性的历史观念。然而,尽管有这种负担,间日疟原虫并不像恶性疟原虫那样引起重视,特别是在撒哈拉以南非洲(SSA)地区。

近年来,人们对阻断疟疾寄生虫从人类向蚊子的传播产生了兴趣,以便控制并最终消除这种疾病。然而,测量感染风险和评估传播阻断活性的效率是复杂的,特别是对于间日疟原虫,由于体外培养系统固有的生物学障碍[3,6]。这使得人们对疟原虫从人传播到蚊子的机制知之甚少,但是在间日疟原虫流行的地区,利用蚊子摄食试验可以克服这种不确定性。

事实上,配子细胞对蚊子的传染性是由许多人、寄生虫和蚊子的因素介导的,包括配子细胞的密度、成熟度和性别比例[7,8,9],蚊子的免疫力[10,11]以及寄生虫与中肠微生物群的相互作用[11,12]。另一个可能阻碍配子体传染性的因素是自然获得的人体免疫,影响无性和有性寄生虫的密度和发育[b]。Duffy抗原血型系统是一种自然耐药机制,其中Duffy阴性的人被认为对间日疟原虫感染具有自然抗性[14,15,16,17],尽管这一教条在最近的研究中受到了挑战。

尽管达菲抗原血型在疟疾流行的国家发挥着至关重要的作用,但对它的研究很少,但随着最近对消除疟疾的兴趣,对达菲抗原的研究数量有所增加。科学范式认为,间日疟原虫的分裂子侵入红细胞需要达菲抗原(也称为达菲抗原趋化因子受体(DARC)或FY基因)作为受体,但在非洲人身上存在问题[14,18,19],这表明寄生虫可能利用其他受体。

Duffy抗原具有三个主要等位基因:FYA、FYB和FYO。在人类中发现了影响Duffy抗原[20]表达的遗传多态性,从而调节间日疟疾的易感性和自然获得性免疫反应。易感性根据相关的Dufy血型抗原(Fya和Fyb)[21]而变化。这解释了疟原虫的传播与人类基因组中的基因选择压力[22]有关,[22]影响人类对蚊子的易感性。

因此,减少传播活动的利用和评价需要更好地了解人类感染库。这是因为理解解释为什么有些人比其他人更具传染性的人类遗传因素可能为制定和评估控制和消除疟疾的新战略提供线索。因此,本研究旨在确定Duffy基因型是否影响间日疟原虫疟疾在埃塞俄比亚奥罗米亚地区的传播。

方法

研究范围及时间

如前所述,该研究于2019年10月至2021年1月在埃塞俄比亚奥罗米亚地区东谢瓦区Adama市政府及其周边地区进行。阿达马距埃塞俄比亚首都亚的斯亚贝巴100公里,海拔1623米,年气温20.5°C,年降水量808毫米。周围的保健中心位于阿达马市25公里半径范围内。阿达玛市及其周边地区位于东非大裂谷,以恶性疟原虫和间日疟原虫共存的季节性疟疾为特点。间日疟原虫是该地区的主要疟疾。因此,目前的研究是对从公共卫生机构(阿达马疟疾诊断中心、阿达马市政府的7个保健中心和周边地区的5个保健中心)招募的发热病人进行的。间日疟原虫阳性患者被运送到膜喂养试验中心。膜喂养试验在阿道麦市行政当局阿道麦公共卫生研究和转诊实验室昆虫中心进行。

研究人群

研究人群是自我报告有发热性疾病的患者,在阿达玛市政府及其周边地区访问了选定的卫生机构,以及在研究期间显微镜下确诊的间日疟原虫阳性患者。

入选标准

由于显微镜检测配子细胞的局限性,5岁及以上无并发症的发热间日疟疾患者被纳入研究,而不考虑配子细胞筛查以包括所有潜在感染个体。

排除标准

年龄< 5岁、单恶性疟原虫感染、严重间日疟原虫感染、孕妇以及一个月内有抗疟药物史的患者均被排除在本研究之外。

样本大小的确定和抽样程序

膜进料试验在后勤上是复杂和昂贵的,因此许多因素被认为是试验中可变性的可能来源。因此,样本量是根据在所选卫生机构方便就诊的患者人数、显微镜下确诊的间日疟原虫感染人数以及研究期间蚊子的可用性来确定的。为了确定跨达菲抗原差异的传播变异,共招募了44例间日疟原虫感染患者进行研究。特意选择这些卫生设施是因为它们靠近进行膜喂养试验的安道麦昆虫中心。然后,方便地招募所有研究期间镜检证实的间日疟原虫阳性患者进行研究。

检测疟原虫感染

到选定的保健中心进行疟疾诊断和治疗的病人被要求提供手指刺血样本。用酒精浸泡的无菌棉清洁手指表面后,从手指刺处采集血液样本,并在一张载玻片上制备薄血膜和厚血膜,并标记患者的身份证号和采集日期。按照方案,薄血片用甲醇固定,厚血片和薄血片分别用2% Giemsa溶液[25]染色。两名熟练的显微镜专家对彼此的结果视而不见,在100倍油浸显微镜下独立检查每个干燥的血膜。第三个阅读者习惯于盲目地阅读结果相互矛盾的幻灯片,他们的大部分阅读都被认为是最终的结果。以8000个wbc /μL计算寄生虫密度,计算公式为(count of parasite count X8000)/(count of wbc Number of counting)。然后通过对两个独立阅读器的读数取平均值来确定寄生虫病。

血液样本的收集和处理

一旦在每个卫生中心通过显微镜确认间日疟原虫感染,就招募患者并将其运送到安道麦公共卫生研究和转诊实验室昆虫中心的蚊子感染实验室。在他们到达后,每个研究参与者都提供了大约5毫升的静脉血。采集血样进行蚊膜摄食试验和分子分析。膜饲养法取含肝素管取血3ml, EDTA管取血2ml。采集后立即将EDTA血液样本按前面所述[26,27]进行一些修改后,在Whatman 3mm滤纸上进行检测。每位受试者取2 ~ 4个血斑,每个血斑约为~ 60 μl,作为干血斑(DBS),干燥后室温保存备用。

疟原虫实时荧光定量PCR (qPCR)鉴定菌种

基因组DNA提取使用QIAamp DNA迷你血液试剂盒,基于制造商的协议,并进行了一些修改。每管加入PBS (1X)/皂苷(0.5%)1 mL,缓冲液ATL 180µL,蛋白酶K 20µL,缓冲液AL 200µL,乙醇200µL(96-100%),缓冲液AW1 500µL,缓冲液AW2 500µL,洗脱缓冲液(AE缓冲液)200µL。采用生产厂家推荐的培养温度、时间和离心速率进行提取。然后将提取的DNA放入1.5 mL埃彭多夫管中,然后在- 20°C冷冻保存直至使用。

对先前描述的细胞色素b的物种特异性片段进行实时PCR扩增,以证实纯间日疟原虫感染恶性疟原虫。间日疟原虫的正向引物为5′-TGCTACAGGTGCATCTCTTGTATTC-3′,反向引物为5′- atttgccccaaggtaaaacg -3′,恶性疟原虫的反向引物为5′- atggatatctggattattattatga -3′,反向引物为5′-TCCTCCACATATCCAAATTACTGC-3′。PCR扩增采用CFX96TM Real-Time PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories Ltd),末量为20 μL, Evagreen HRM Mix(5倍)4 μL,每种引物0.5 μL, DNA模板5 μL。热条件为94°C 15分钟,在94°C下30秒,在58°C下1分钟,72°C下1.5分钟,72°C下10分钟,然后是20°C冷却步骤。每次PCR均以水为阴性,间日疟原虫DNA密度估计为8000只/µL,恶性疟原虫DNA密度为5 ng/µL为阳性对照。qPCR Ct值是根据每个间日疟原虫检测阳性样本的阈值200来计算的。

Duffy基因分型

采用PCR扩增方法对间日疟原虫人分离株进行Duffy基因分型,方法如前所述[23,29]。每个PCR含有33 μL分子水,每个引物1 μL, 5X HOT混合Taq聚合酶(Sotis biodyne) 10 μL, DNA模板5 μL,总体积为50 μL。混合物在94°C下变性15 min,然后在94°C下变性20 s, 60°C下变性20 s, 72°C下变性1 min,最后在72°C下变性10 min。FY基因GATA-1转录因子结合位点和DARC基因外显子2的引物已在[23]中描述过。PCR产物经agcourt AMPure XP微珠纯化后,送往法国Biofidal公司进行Sanger测序。使用CLC Genomics Workbench 22.0 (Qiagen, Germany)软件分析两条链上测序的核苷酸。本研究生成的序列与其各自的参考序列进行比对。

蚊膜饲养试验

利用安道麦公共卫生研究和转诊实验室昆虫养殖的阿拉伯按蚊菌落进行了蚊膜摄食试验。该所设在埃塞俄比亚奥罗米亚州东谢瓦区阿达马市政府疟疾诊断中心。饲养条件为温度24 ~ 27℃,相对湿度70 ~ 90%。

用口吸法选取饥饿的雌性按蚊,用蚊帐将其分配到纸杯中(每杯40只)。带Parafilm的玻璃给膜机配有恒温水浴机,水温保持在37℃。将肝素化管采集的静脉血立即充注到玻璃喂食器中,让蚊子通过Parafilm在黑暗处进食30 min ~ 1 h。维持恒定37°C的循环水系统以防止小配子细胞脱落。饲喂后1 h,用吸引器将非血喂养的蚊子取出,置于另一个杯子中杀死,血喂养的蚊子转移到一个大的蚊子饲养笼中,在最佳生物安全标准下维持,直到解剖。每个笼上放置10%的蔗糖溶液浸渍棉絮,每日更换,直至解剖期(如前所述[30])。

蚊虫感染状况的测定

吸血后7 ~ 8天,将蚊子置于- 20°C冷冻室中10 min,使其固定。在显微镜载玻片上滴1%红霉素溶液,在立体显微镜下解剖中肠,并用盖片覆盖红霉素解剖的中肠。20 ×magnification显微镜下检测卵囊,检查蚊虫中肠感染情况。按照标准程序[30]对每只蚊子的卵囊数量进行计数和记录。采用带相机的显微镜,通过投影的方法确定卵囊的存在和负载,并将图像手动捕获到桌面(计算机)。

统计分析

数据输入Epi-Data 3.1版本,导出到SPSS (Statistical Package for Social Sciences) 25版本进行分析。采用描述性统计方法,用图形和表格描述蚊虫感染频率、达菲基因型、表型和其他相关变量。所有图表均使用GraphPad Prism 8.0版软件绘制。测定与达菲抗原多态性相关的卵囊水平差异。以P≤0.05为差异有统计学意义。

道德的间隙

获得了亚的斯亚贝巴大学(AAU)机构审查委员会(IRB)、Aklilu Lemma病理生物学研究所(ALIPB)和国家研究伦理审查委员会的伦理批准。研究参与者、他们的父母或监护人收到了关于他们的权利、研究目的和程序的详细说明。参与者被告知,这个过程可能会在抽血的地方引起轻微的疼痛。该研究的参与者按照国家治疗指南接受治疗。参与者和/或其监护人有权在研究期间的任何时候拒绝或退出研究。在整个研究过程中,所有参与者都被保证保密。


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背景
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结果

Des研究参与者的描述

在2019年10月至2021年1月期间,从便利登记的44例有症状的间日疟原虫感染患者中采集血样,通过人工膜喂养方式喂给实验室饲养的按蚊。大多数(75%)研究参与者为男性,并从城市(安道麦市政府)驻地(68.2%)招募。近43%的研究参与者年龄在25-44岁之间。超过一半(52.3%)的参与者曾经结婚(已婚、分居和离婚)(表1)。

表1埃塞俄比亚奥罗米亚地区东谢瓦区研究参与者的人口统计学特征

蚊子感染的频率间日疟原虫

在44次取食试验中,实验室饲养的按蚊总体充血取食率为63.3%(5257/8300只暴露蚊子)。平均21只(范围:5-60只;IQR: 10-28),共907只中肠解剖蚊。近33%(32.8%)的中肠解剖蚊感染卵囊。被解剖和感染蚊子的数量的详细资料载于表2。通过显微镜检测卵囊,发现人对蚊虫的传染性比例为77.3%(34/44次饲养试验)(表2)。

表2埃塞俄比亚奥罗米亚地区东谢瓦区暴露于膜食试验的蚊子特征细节

达菲血型基因分型、寄生虫血症、配子细胞血症和蚊虫感染

达菲血型基因分型

对44例间日疟原虫感染患者的血样成功进行了Duffy基因分型。大多数(68.2%)研究参与者为杂合型达菲血型(TCT/CCT)。Duffy基因型以FY*B/FY*BES最常见(36.4%),其次是FY*A/FY*BES基因型(29.5%)。研究中检测到的最常见表型分别为45.5%和38.6%的参与者中观察到的Fy (a−b +)和Fy (a + b−)(表3)。

表3达菲血型的基因型和表型频率间日疟原虫埃塞俄比亚奥罗米亚州东谢瓦区感染患者

寄生虫病和配子体贫血

间日疟原虫寄生虫密度中位数(范围)为6188(419-42,833)只/µL,配子细胞血症中位数(范围)为80(0-2785)只/µL(数据未显示)。虽然与纯合子达菲血型患者相比,杂合子达菲血型患者的间日疟原虫寄生血症和配子细胞血症的平均值降低,间日疟原虫配子细胞血症的平均值增加,但在达菲血型之间没有显著差异(表4)。

表4达菲血型患者寄生血症及配子体血症水平间日疟原虫埃塞俄比亚奥罗米亚州东谢瓦区感染患者

蚊子感染

对蚊子传染性进行定性估计(至少有一只携带卵囊的蚊子呈阳性)和定量估计(每只被解剖的蚊子的平均卵囊数)。

定性评估

患者血液间无明显差异,导致至少有一只蚊卵囊阳性,包括达菲血型,见表5。纯合子Duffy阳性个体(TCT/TCT, N = 30)携带至少1只阳性卵囊的蚊批比例高于杂合子(TCT/CCT, N = 14),但差异无统计学意义。携带FY*B/FY*B (N = 4)和FY*A/FY*B (N = 6)基因型的研究对象对按蚊的感染性更强(两组均为100%)。在25-44岁、已婚和农村居民中,含有至少一只卵囊阳性蚊子批次的比例相对较高(表5)。

表5埃塞俄比亚奥罗米亚地区东谢瓦区从参与者特征来看至少有一只蚊卵囊阳性

定量评估

杂合子Duffy阳性个体(TCT/CCT)的卵囊密度相对高于纯合子Duffy阳性个体(TCT/TCT)(均值分别为200.5和101.9)(图1),但差异无统计学意义(P = 0.34)。饲喂FY*B/FY*BES基因型的中肠解剖蚊的平均卵囊负荷显著高于饲喂FY*B/FY*B基因型的蚊(P = 001)。总体而言,FY*B/FY*BES和FY*A/FY*BES的卵囊负荷范围大于其他基因型(图2)。

图1
figure 1

埃塞俄比亚奥罗米亚地区东谢瓦区达菲阴性和达菲阳性症状患者卵囊水平的比较

图2
figure 2

埃塞俄比亚奥罗米亚地区东谢瓦区Duffy血型基因型与中肠解剖蚊卵囊密度的关系



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