2023-10-19 06:00

外泌体装载irf1的大鼠脂肪源性干细胞片有助于糖尿病足溃疡的伤口愈合

摘要

背景

细胞治疗已被认为是治疗糖尿病足溃疡的一种新技术,细胞片工程可提高细胞移植的疗效。本研究旨在探讨装载外泌体干扰素调节因子1 (IRF1)的大鼠脂肪源性干细胞(ASC)片在足部创面愈合中的可能分子机制。

方法

用链脲佐菌素致大鼠糖尿病,然后测量伤口组织中miR-16-5p的表达。利用荧光素酶活性、RNA拉下和染色质免疫沉淀法分析IRF1、microRNA (miR)-16-5p和反式转录因子5 (SP5)之间的关系。IRF1在大鼠ASCs (rASCs)中过表达或加载到rASC薄片上,然后从rASCs中提取外泌体。因此,我们评估了irf1 -外泌体或IRF1-rASC薄片对成纤维细胞增殖和迁移以及内皮细胞血管生成的影响。

结果

miR-16-5p在糖尿病大鼠创面组织中表达不足。过表达miR-16-5p促进成纤维细胞增殖和迁移,促进内皮细胞血管生成,从而加速伤口愈合。IRF1是上游转录因子,可以结合miR-16-5p启动子并增加其表达。此外,SP5是miR-16-5p的下游靶基因。来自rasc的irf1外泌体或IRF1-rASC薄片通过mir -16-5p依赖性抑制SP5促进糖尿病大鼠足部伤口愈合。

结论

本研究表明,外泌体irf1负载的rASC片调节miR-16-5p/SP5轴促进糖尿病大鼠伤口愈合,这有助于开发基于干细胞的糖尿病足伤口治疗策略。

介绍

根据世界卫生组织的数据,全球糖尿病(DM)患病率估计超过4.15亿人,到2040年可能会翻一番(Schacter and Leslie 2017)。糖尿病是一种以慢性高血糖为特征的异质性代谢紊乱(Petersmann et al. 2019),与多种大血管和微血管并发症相关,包括心血管疾病、糖尿病视网膜病变(Cole and Florez 2020)。糖尿病足溃疡是慢性伤口,是糖尿病的常见并发症(Ghotaslou et al. 2018)。糖尿病足溃疡导致频繁复发,并与高死亡率相关。糖尿病足溃疡的早期诊断和有效管理是降低发病率和死亡率的必要条件(Schmidt and Holmes 2018)。

越来越受关注的是从脂肪来源的干细胞(ASCs)中释放的外泌体用于促进糖尿病小鼠伤口愈合的治疗用途(Shi et al. 2020)。值得注意的是,在2型糖尿病大鼠模型中,ASC片联合人工皮肤的同种异体移植已被证实可促进糖尿病伤口愈合(Kato et al. 2017)。有证据表明,在脂肪来源的间充质祖细胞中存在干扰素调节因子1 (IRF1) (Friesen et al. 2017)。有趣的是,IRF1驱动人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖、迁移和血管生成潜能,有助于糖尿病足溃疡的伤口愈合(Cai et al. 2019)。miRGen数据库的初步分析预测IRF1和microRNA (miR)-16-5p之间存在假定的结合位点。最近的证据表明,miR-16调节胰岛素抵抗和其他导致糖尿病发展的致病条件(Kaur et al. 2020)。此外,人尿源性干细胞外泌体介导miR-16-5p的强制表达可以保护人足细胞免受高糖诱导的足细胞凋亡(Duan et al. 2021)。此外,starbase数据库分析预测反式作用转录因子5 (SP5)是miR-16-5p的下游靶基因。抑制SP5表达可使asc细胞外囊泡分泌的miR-486-5p促进伤口愈合过程(Lu et al. 2020)。因此,本研究旨在提供实验证据来验证mir -16-5p介导的SP5表达参与了大鼠ASC (rASC)薄片上负载的IRF1过表达修饰外泌体(IRF1-exosome)在糖尿病创面愈合中的假设。

材料与方法

道德声明

本研究经南昌大学第一附属医院医学研究伦理委员会动物伦理委员会(No. 2021-028)批准,按照《实验动物护理与使用指南》进行。

Microarray-based剖析

从Gene expression Omnibus (GEO)数据库下载DM足溃疡相关miRNA数据集GSE68185和溃疡皮肤创面愈合相关miRNA数据集GSE174661。通过miRPathDB数据库预测涉及miRNAs的京都基因基因组百科全书(KEGG)信号通路,选择的证据集为Experiment (union),显示至少涉及两个miRNAs的通路和至少涉及两个信号通路的miRNAs。从GSE174661表达谱中纳入的溃疡皮肤组织(对照组,n = 5)和皮肤创面愈合组织(治疗组,n = 10)中提取miR-16-5p表达,采用Weltch t检验统计方法评价其差异表达,p值< 0.05认为有统计学意义。通过miRbase数据库,对人、小鼠和大鼠之间的miRNA序列进行BLAST比对。利用miRGen数据库预测miRNA上游转录因子及结合位点。使用miRmap数据库预测miRNA与下游靶基因的结合位点。

DM大鼠模型的建立

12周龄雄性SD大鼠112只(体重185-240 g;饲养条件:24±2°C, 50±10%湿度,12 h明暗循环。大鼠适应环境1周后造模。链脲霉素(STZ;Beyotime, Shanghai, China)溶解于0.1 M磷酸柠檬酸缓冲液中,以55 mg/kg的剂量单独注射到SD大鼠腹膜。两周后,SD大鼠禁食一夜后,从尾静脉采血,随后测量血糖水平。血糖水平超过250 mg/mL表明DM建模成功(Yang et al. 2019)。在体动物实验过程见附加文件1:图S1。

从未注射STZ的小鼠分离正常足部组织和足部创面组织,分别作为正常对照组(n = 8)和非dm对照组(n = 8)。DM大鼠给予高脂高糖饮食,分为DM组、对照组、agomir阴性对照组(NC)、miR-16-5p agomir组、过表达组(oe)-NC组、oe- irf1组、oe- irf1 + antagomir NC组、oe- irf1 + miR-16-5p antagomir组、外泌体组、irf1 -外泌体组、rASC薄片组和IRF1-rASC薄片组(n = 8)(附加文件3:表S1)。

有限公司DM大鼠足部创面的构建

在异氟醚麻醉下,刨去大鼠足后部5毫米伤口。使用1 mL注射器,沿伤口边缘和中心注射0.5 mL 50 nM agomir NC、miR-16-5p agomir、miR-16-5p antagomir和0.5 mL磷酸缓冲盐水(PBS)、外泌体(1 × 1011 /mL)或e- irf1外泌体(1 × 1011只小鼠/mL),每天1次,连续2天。第二次注射24小时后,用4-0缝线缝合创面周围皮肤及创面下方软组织,防止创面收缩,异氟醚麻醉下干预。手术后,使用安装在三脚架上的奥林巴斯SP-800 UZ相机在固定距离拍摄伤口。随后对大鼠进行复苏并每天观察其伤口(Liu et al. 2019)。用agomir NC (miR4N0000001-4-5, RiboBio,广州,中国)、miR-16-5p agomir (miR40000785-4-5, RiboBio)、antagomir NC (miR3N0000001-4-5, RiboBio)和miR-16-5p antagomir (miR30000785-4-5, RiboBio)治疗大鼠。

rasc的分离与鉴定

从12周龄正常健康雄性SD大鼠(体重250 g)的腹股沟脂肪组织中分离出rasc。将分离的脂肪组织用0.1% I型胶原酶(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)在37℃下处理1小时。700 g离心5 min后收集间质血管部分,将间质血管部分细胞用含有20%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素(Beyotime)的α-最低必需培养基(MEM) Glutamax重悬。细胞(1 × 106个/mL)接种于60 cm2的原代组织培养皿中,37℃5% CO2培养箱中培养。24 h后,用PBS洗涤碎片,加入新鲜培养基。第3天将细胞转移到含有0.2%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)的新培养皿中。每3天进行一次传代(1.7 × 103个细胞/cm2),直到传代3。

在CyAn ADP分析仪(Beckman Coulter)上用流式细胞术检测表面标记物对rasc进行了表征。(Kato et al. 2015)。细胞用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD14 (PA5-78,957, Thermo Fisher Scientific)、CD19 (JF099-9, Thermo Fisher Scientific)、CD105 (OTI8A1, Abcam Inc, Cambridge, UK)、CD34 (EP373Y, Abcam)、CD44 (EPR18668, Abcam)、CD45 (ab10558, Abcam)、CD73 (4G6E3, Abcam)和CD90 (ab225, Abcam)以及主要组织相容性复合物II类DR (HLA-DR) (1:100;以fitc -免疫球蛋白G (IgG) (A0556, Beyotime)作为同型对照。

进一步评估rASC分化。为了诱导成骨分化,rasc在成骨细胞培养基(Cyagen, Guangzhou, China)中培养,每2-3天更新一次培养基。14 ~ 28 d后,用茜素红(Beyotime)染色。为了诱导成脂分化,rasc在成脂分化培养基(Cygen)中培养。3 d后更换维持培养基,1 d后更换诱导培养基。诱导/维持培养基交换3个周期后,rasc在维持培养基中再培养7 d,然后用油红O染色(Beyotime)观察细胞内脂质积累情况。对于诱导软骨分化,rasc悬浮液(体积:500 μL;细胞密度:5 × 105/mL),在1200 rpm/min下离心5min。48h后,rasc变成球形,然后在成软骨培养基(Cyagen)中培养,每2-3天更换一次培养基。21天后,用阿利新蓝(Beyotime)染色细胞颗粒(Zhang et al. 2016)。使用显微镜(IX71;奥林巴斯,东京,日本)。

rasc外泌体的分离与鉴定

用表达IRF1的慢病毒上清液和5 μg/mL的聚凝剂(Beyotime)孵育rASCs 24 h。感染48 h后,用盐酸嘌呤霉素(Thermo Fisher Scientific)筛选感染的rASCs。

rASC用不含fbs的rASC培养基培养。48小时后,收获条件培养基(CM),通过差速超离心在4°C下分离外泌体(Wei et al. 2017)。400g离心10分钟后,CM在2000g离心15分钟。收集上清,用0.22 m过滤器过滤。过滤后的CM在4000g下用100 kDa超滤管离心浓缩至1/30体积。然后将浓缩物在100,000g下离心70分钟,去除上清。将微球用200 μL PBS重悬备用。

在JEOL 1200EX (JEOL USA)透射电镜下观察分离的外泌体的形态。马萨诸塞州皮博迪(Peabody, MA)。采用NanoSight NS300纳米颗粒示踪分析仪(NTA;马尔文仪器有限公司,上海,中国)。Western blot检测表面标记物(CD9 [ab92726, Abcam], ALG-2相互作用蛋白X [Alix;ab275377, Abcam]与肿瘤易感性101 [Tsg101;[ab12501, Abcam]) (Huang et al. 2021)。

rASC片材施工及皮肤创面移植

将分离的rasc (1.5 × 105个/皿)接种于35 mm的温度响应皿中(UpCell;CellSeed,东京,日本),在完全培养基中培养3天。细胞在含抗坏血酸(16.4 μg/mL)的完全培养液中培养4-5天。温度降至室温后,细胞自发分离成连续的细胞片,用镊子从培养皿中收获细胞片。

实验组大鼠创面上放置构建好的薄片,实验组和对照组均覆盖15 × 10 mm的人工皮肤(PELNAC;Smith & Nephew,东京,日本)。异氟醚麻醉下,创面周围皮肤及下方软组织采用4-0缝线缝合,防止创面收缩和干扰。为了保护创面,使用20 × 15 mm无粘胶敷料(Hydrosite Plus[在美国称为ALLEVYN无粘胶敷料])用4-0缝线缝合人工皮肤顶部;史密斯&侄子,东京,日本)保持伤口湿润和吸收分泌物。

苏木精和伊红(HE)及马松染色

大鼠创面组织用美沙他定溶液固定48 h, 60%乙醇固定72 h,石蜡包埋,切片。(4毫米厚)。切片用苏木精染色,再用伊红反染色。在光学显微镜下观察切片的形态和结构变化(Huang et al. 2020)。

切片用0.5%碘处理10分钟,5%硫代硫酸钠处理5分钟,然后在马尾松- ponceau-acid品红溶液(中国上海谷多生物科技有限公司)中染色8分钟。切片用2%醋酸水溶液浸泡,1%磷酸钼酸水解,苯胺蓝染色。在光学显微镜下捕获图像(Flores-Costa et al. 2018)。

免疫组织化学和免疫荧光染色

用异氟醚麻醉大鼠,并用高浓度二氧化碳使其安乐死(Artwohl et al. 2006)。取所有大鼠伤口皮肤,4%多聚甲醛固定12 h, 30%蔗糖4℃浸泡12 h,切成14 μm厚的切片。用兔抗cd31一抗(ab222783, Abcam)在4°C下免疫染色过夜,使用免疫组织化学试剂盒(g1215 - 200t, Seville Biotechnology, Ltd,武汉,中国)。接下来,切片用苏木精反染,在光学显微镜下观察。

免疫荧光方面,切片用1.5%山羊血清阻断,用兔抗CD31和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) (ab150301, Abcam)一抗在4℃下孵育过夜。次日,切片用Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG (GB25303, Seville Biotechnology Limited,中国武汉)和cy3标记的山羊抗兔IgG (GB21303, Seville Biotechnology Limited)孵育。使用徕卡荧光显微镜(Zeiss Observer Z1)和数码相机(Axiocam 503 Mono)拍摄图像。

成纤维细胞和内皮细胞的培养

大鼠成纤维细胞Rat2 (CRL-1764)和内皮细胞YPEN-1 (CRL-2222™)购自American Type Culture Collection (ATCC;马纳萨斯,弗吉尼亚州)。内皮细胞在添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和1%内皮细胞生长补充剂/肝素试剂盒(ECGS/H, C-30140, Promocell,德国)的Dulbecco's modified eagles培养基(DMEM)中培养,37℃,5% CO2培养箱中培养。成纤维细胞在含15% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的高糖DMEM中培养,37℃。

细胞转染

按照说明使用HiPerFect转染试剂(QIAGEN, Valencia, CA)用模拟物NC (miR1N0000001-1-5, RiboBio)、miR-16-5p模拟物(miR10000785-1-5, RiboBio)、抑制剂NC (miR2N0000001-1-5, RiboBio)或miR-16-5p抑制剂(miR20000785-1-5, RiboBio)转染细胞。

使用慢病毒过表达载体(LV4, GenePharma,上海,中国)和干扰载体(pGPU6/GFP, C02007, GenePharma)。慢病毒载体携带o -IRF1、o - sp5、o - nc、短发夹RNA (sh)-IRF1和sh- nc,购自Sigma-Aldrich (St Louis, MO)。病毒滴度为109 TU/mL。将细胞以2 × 105个/孔的密度接种于6孔板中,培养24 h,用上述慢病毒载体感染72 h,用含4 μg/mL嘌呤霉素的新鲜培养基替换,细胞培养至少14 d。将耐药细胞在2 μg/mL含嘌呤霉素的培养基中扩增9 d,然后转移到不含嘌呤霉素的培养基中,获得稳定的低敲或过表达细胞。sh-IRF1-#1序列为5′- gctagagatgcagattaattc -3′。附加文件3:表S2描述了这些组。

5-乙基-2 '脱氧尿苷(EdU)测定

将待测细胞接种于24孔板中,在添加EdU (Beyotime;10µmol/L),固定2 h。用含4%多聚甲醛的PBS溶液固定细胞,用含0.5% Triton X-100的PBS孵育。然后用4 ' 6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色,在荧光显微镜(Olympus)下随机观察6-10个视场(Zhan et al. 2018)。

划痕试验和容器状管形成试验

细胞(4 × 105个/孔)接种于6孔板。当细胞达到90-100%合流时,用10 μL无菌移液管尖缓慢垂直刮4-5次。然后用无血清培养基培养细胞。在倒置显微镜(IX53, Olympus)下于0和24 h获取图像,观察细胞迁移(Zhu et al. 2019)。

如前所述,在细胞外基质(ECM)凝胶中检测内皮细胞中的血管样管形成(Zhou et al. 2021)。用ECM凝胶(E1270, Sigma-Aldrich)覆盖含有80000个内皮细胞的混悬液(200 μL),加入24孔板(200 μL/孔)。8 h后,在光学显微镜下观察管的形成。

双荧光素酶报告试验

将预测的目标SP5或IRF1野生型(WT)和突变型(MUT)序列插入psiCHECK2载体(HanBio Biotechnology Co., Ltd, Shanghai, China)。使用Lipofectamine 2000试剂(11668030,Thermo Fisher Scientific),将mimic- nc /miR-16-5p mimic和IRF1-WT/IRF1-MUT或SP5-WT/SP5-MUT(附加文件3:表S3)共转染到HEK293T细胞(CRL-11268;使用Dual-Luciferase®报告基因分析系统(E1910, Promega)检测荧光素酶活性,以renilla荧光素酶作为上料对照。

RNA下拉试验

用pMIR载体将IRF1 (HanBio)表达于HEK293T细胞后,分别用WT生物素化的miR-16-5p和MUT生物素化的miR-16-5p(各50 nM)转染细胞48 h。用特异性裂解缓冲液(Ambion, Austin, Texas)裂解细胞,并引用50 μL细胞裂解液样品。剩余裂解液与预先包被RNase-free和酵母tRNA (Sigma-Aldrich)的M-280 streptavidin beads (S3762, Sigma-Aldrich)在4℃下孵育3小时。结合RNA用Trizol纯化,用逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测IRF-1的富集。

染色质免疫沉淀(ChIP)试验

采用RNA聚合酶II抗体(ab238146, Abcam)和IRF1抗体(ab230652, Abcam)和EZ-ChIP™试剂盒(17-371FR, EMD Millipore, Billerica, MA)进行ChIP检测。用甲醛固定细胞产生交联,然后超声到300-500 bp染色质。将裂解液加入微孔中,用相应抗体固定。从蛋白质-DNA复合物中释放DNA,纯化和洗脱,然后用RT-qPCR检测。使用Input和IgG来确认检测到的信号是否来自特定染色质与IRF1或RNA聚合酶II蛋白的结合。

RNA提取和RT-qPCR

用TRIzol法从细胞中提取总RNA,用Primescript RT Kit (RR047A, Takara, Dalian, China)和Primescript miRNA RT Kit (638315, Clontech, Palo Alto)将提取的RNA逆转录成互补DNA。采用RT-qPCR试剂盒(Q511-02,南京Vazyme生物技术有限公司,南京,中国),在Bio-rad实时荧光定量PCR仪CFX96上进行RT-qPCR,归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和U6。引物序列由Sangon (Shanghai, China)设计并提供,见附加文件3:Table S4。采用相对定量法(2−△△Ct法)计算褶皱变化。

Western blot法

用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解缓冲液(含1%蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂(Beyotime))从细胞中提取总蛋白,使用bicinchoninic酸(BCA)测定试剂盒(A53226, Thermo Fisher Scientific)评估浓度。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后,将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%牛血清白蛋白(BSA)阻断后,用兔抗SP5抗体(1:1000;TF8742R,上海景丰生物科技有限公司,上海,中国),GAPDH (1:10 000;G9545 Sigma-Aldrich;加载控制)。然后用hrp标记的山羊抗兔二抗IgG (1:2000;用化学发光仪观察膜上的免疫复合物,用ImageJ 1.48 u软件定量波段强度。

统计分析

本研究数据采用SPSS 21.0统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),多组比较采用Tukey事后检验。采用重复测量方差分析和Tukey事后检验对不同时间点的数据进行比较。p < 0.05有统计学意义。


目录


摘要
介绍
材料与方法
结果
讨论
结论
数据和材料的可用性
缩写
参考文献
致谢

作者信息
道德声明

补充信息



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