2023-10-19 06:00

斑蝥素增加离体人心房收缩力和蛋白磷酸化

摘要

斑蝥素是蛋白磷酸酶1 (PP1)和蛋白磷酸酶2A (PP2A)的抑制剂,已知在人心室制剂中增加收缩力并缩短松弛时间。我们假设斑蝥素在人右心房附件(RAA)制剂中具有类似的正性肌力作用。RAA是在人类患者的搭桥手术中获得的。这些小梁安装在器官浴中,以1hz的频率电刺激。为了比较,我们研究了离体电刺激左心房(LA)制剂和离体自然跳动右心房(RA)制剂。累积应用(从10到30µM开始),斑蝥素在RAA, LA和RA制剂中发挥了积极的浓度依赖性肌力作用,在300µM时趋于稳定。这种正性肌力作用伴随着人类心房制剂(HAPs)放松时间的缩短。值得注意的是,斑蝥素没有改变RA制剂中的心率。此外,斑蝥素(100µM)增加了RAA制剂中磷蛋白的磷酸化状态和肌钙蛋白I的抑制亚基,这可能是观察到的更快弛豫的原因。生成的数据表明PP1和/或PP2A在人类心房收缩性中发挥功能作用。

介绍

有充分的证据表明蛋白磷酸酶在人类心脏中有表达。例如,β-肾上腺素能刺激增加了人类心脏的收缩力和心跳率(图1)。当代理论解释了这些作用的机制,其基础是一个信号转导系统,包括β-肾上腺素受体的激活,通过刺激鸟苷-三磷酸(GTP)结合蛋白激活腺苷酸环化酶,以及3´5´-环磷酸腺苷(cAMP)的形成。随后,在工作心肌中,cAMP激活磷酸化的激酶,例如。蛋白激酶(PKA),从而激活调节蛋白。β-肾上腺素能刺激的肌力效应最终可以通过激活心肌肌丝的胞质Ca2+的增加来解释。这些磷酸化是动态逆转的;通过这种方式,β-肾上腺素能刺激的肌力效应是通过蛋白磷酸酶实现的(Gombosova et al. 1998;Neumann et al. 1999;Herzig and Neumann 2000)。在本研究中,我们重点关注PP1和PP2A,因为它们构成了心脏蛋白磷酸酶的大部分,并且都能够使磷蛋白和肌钙蛋白I去磷酸化(Herzig和Neumann 2000, Neumann等人2021,Wijnker等人2011,Gergs等人2019b, Neumann等人1999)。我们在之前的研究中已经证明斑蝥素抑制豚鼠和人心脏制剂中PP1和PP2A的纯化催化亚基(Neumann et al. 1995a, b;link et al. 1996)。此外,在用放射性正磷酸盐(32P)标记的豚鼠心室心肌细胞中,我们检测到斑斑素诱导了几种心脏蛋白的放射性随时间和浓度的增加(Neumann et al. 1995a, b),其中我们鉴定了磷蛋白和肌钙蛋白抑制亚基肌钙蛋白I (TnI) (Neumann et al. 1995a);b).我们观察到斑蝥素增加了豚鼠乳头肌和人心室制剂的收缩力(Neumann et al. 1995a, b;link et al. 1996)。据我们所知,目前还没有发表过关于斑蝥素在人心房制剂或小鼠心房制剂中的作用的研究,本研究是为了进行比较。同样,斑蝥素增加细胞的收缩性(从而扩大细胞壁运动),增加通过l型Ca2+通道的电流,增加豚鼠心室心肌细胞的胞质Ca2+浓度(Ca2+瞬态)(Neumann等,1995a, b;Bokník et al. 2000)。我们已经证明斑蝥素也增加了离体灌注大鼠心脏的磷蛋白和TnI磷酸化(Bokník et al. 2001)。其他研究用有趣的发现扩展了我们的数据。例如,有报道称,在30µM时,斑蝥素开始在离体犬脑室小梁中发挥正性肌力作用(Chu et al. 2003),斑蝥素增加了去甲肾上腺素在离体犬脑室小梁中的正性肌力作用(Chu et al. 2003)。

图1
figure 1

斑蝥素在心肌细胞中的作用机制。β-肾上腺素能刺激通过刺激鸟苷-三磷酸(GTP)结合蛋白(Gs)和更多的3′,5′-环腺苷单磷酸(cAMP)的形成,增强了肌膜中腺苷环化酶(AC)的活性。此后,cAMP激活磷酸化蛋白激酶(PKA),从而激活调节蛋白。β-肾上腺素能刺激增加激活肌原纤维的胞浆Ca2+。利用不同的机制,即mlc激酶活性增强,肌球蛋白轻链20 (MLC20)的磷酸化增加了肌丝对Ca2+的亲和力,从而增强了收缩力。lCa2+可以通过l型Ca2+通道(LTCC)。Ca2+可以通过ryanodine受体(RYR)从肌浆网(SR)释放。磷蛋白(PLB)的磷酸化抑制SR-Ca2 + - atp酶(SERCA)的活性,从而促进松弛。抑制亚基肌钙蛋白(TnI)的磷酸化降低了肌丝的ca2 +敏感性,也加速了松弛。PLB、MLC20和TnI均可被PP1和PP2A去磷酸化。斑蝥素可以抑制PP1和PP2A的酶活性(见附图中的结构式,一种天然分子)。

有趣的是,在豚鼠静止心肌细胞中,异丙肾上腺素只增加了磷蛋白中16号氨基酸丝氨酸的磷酸化,而斑蝥素在相同条件下增加了磷蛋白对16号氨基酸丝氨酸和17号氨基酸丝氨酸的磷酸化状态,这表明磷蛋白中这些氨基酸的蛋白磷酸酶活性是恒定的(Bokník et al. 2001)。我们观察到斑蝥素的松弛作用与豚鼠乳头肌中磷蛋白丝氨酸16磷酸化之间存在良好的时间相关性,表明两者之间存在因果关系(Bokník et al. 2001)。

我们测试了以下主要假设:(1)斑蝥素增加了人类心房中重要调节蛋白的磷酸化。(2)斑蝥素增加人体心房收缩力。(3)斑蝥素增加人体心房的松弛。关于这项研究的进展报告之前以摘要的形式发表过(Schwarz et al. 2022, 2023)。

材料与方法

有限公司老鼠的神经研究

如先前的研究所述,从小鼠身上分离出左、右心房制剂并置于器官浴中(Gergs等人,2013;Neumann et al. 2003)。器官浴液中含有119.8 mM NaCI、5.4 mM KCI、1.8 mM CaCl2、1.05 mM MgCl2、0.42 mM NaH2PO4、22.6 mM NaHCO3、0.05 mM Na2EDTA、0.28 mM抗坏血酸和5.05 mM葡萄糖。沐浴液连续加入95% O2和5% CO2,并保持在37°C和pH值7.4 (Neumann et al. 1998,2003;Kirchhefer et al. 2004)。采用小鼠自搏右心房制剂研究其致时效应。

给药方法为:达到平衡后,在左房、右房制剂中累积加入斑蝥素,建立浓度-反应曲线。然后,在有指示的地方,将甲酚累积应用于制剂。最后,在反应稳定且无任何洗脱后,在部分实验中加入1µM异丙肾上腺素检测疗效。此外,在一些研究中,我们建立了在存在和不存在30µM斑蝥素的情况下,对异丙肾上腺素(0.1 nM至1µM)的累积浓度响应曲线。此外,在斑蝥素的正性肌力作用达到稳定的平台后,我们将夹持跳动的左心房制剂在100µM斑蝥素的存在下冷冻。

有限公司人心房制剂的神经学研究

使用与小鼠研究相同的装置和缓冲液,对人心房制剂进行了收缩性研究(第2.1节)。样本来自9名男性患者和4名女性患者,年龄34-82岁。药物治疗包括美托洛尔、呋塞米、阿哌沙班和乙酰水杨酸。我们对人类样本进行心房收缩研究时使用的方法已在先前的研究中进行了描述,并且在本研究中没有改变(Gergs et al. 2009, Gergs et al. 2018;Boknik et al. 2019)。我们将取自人体心房的样品冷冻在液氮中,然后进行Western blotting(第2.3节)。此外,在一些研究中,我们建立了在存在和不存在100µM斑蝥素的情况下,对异丙肾上腺素(0.1 nM至1µM)的累积浓度响应曲线。

西方墨点法

样品的均质化、蛋白质测量、电泳、一抗和二抗孵育和定量均按照我们之前制定的方案进行(Gergs等人,2009,2019a,b;Boknik et al. 2018)。我们将冷冻样品匀浆,用变性凝胶电泳分离蛋白质,然后通过电泳将蛋白质转移到膜上。用特异的第一抗体孵育膜,随后用第二抗体孵育膜。首先使用的抗体是:抗calsequestrin (CSQ)抗体,Santa Cruz (1:20 000;猫。# sc390999),抗磷蛋白(pSer16)抗体(1:5000;巴德利亚,利兹,英国,猫。# A-010-12),抗肌球蛋白轻链(MLC)抗体(1:5000;Abam, Cambridge, MA, USA, Cat# ab2480),抗磷酸肌钙蛋白I (P-TnI)抗体,(1:5000;细胞信号,丹佛斯,MA, USA, Cat。# 4004)。

数据分析

数据以平均值±平均值的标准误差表示。采用方差分析和Bonferroni t检验估计统计显著性,p值< 0.05被认为是显著的。

药品和材料

药物盐酸异丙肾上腺碱、斑蝥素(cantharidin, 100 mM in dismethylsulphoide (DMSO))、carbachol (CAR)购自Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)。本研究中使用的所有其他化学品均为市售的最高纯度等级。实验全程使用去离子水,每日新鲜配制原液。


目录


摘要
介绍
材料与方法
结果
讨论
数据可用性
参考文献
致谢

作者信息
道德声明




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结果

斑蝥素以时间和浓度依赖的方式增加了离体左心房电节律制剂的收缩力(图2A)。斑蝥素的正性肌力作用在10µM时可见(图2D)。15分钟后,我们测量了收缩力。随后加入更高浓度的斑蝥素。在加入下一个浓度的斑蝥素之前测量收缩参数。在这些从人类患者分离的电节奏左心房制剂中观察到的斑斑素效力与从豚鼠左心房制剂中观察到的效力相似(Neumann et al. 1995a, b)。在高时间分辨率下,肌力效应可以叠加(图2B,图2C)。总结这些数据,我们观察到浓度高达100 μ M(图2D)时产生的张力增加(图2D)。斑蝥素既不缩短也不延长松弛时间(t2,图2E),也不延长张力峰值时间(t1,图2E)。然而,斑蝥素增加了左心房准备中张力发展速率和弛豫速率的绝对值(图2F)。

图2
figure 2

斑蝥素增加小鼠左心房收缩力。A:小鼠左心房制剂原始记录。可见斑蝥素诱导的正性肌力作用具有时间和浓度依赖性。B:如A所示的原始记录,但此处显示的是以毫秒为单位的高时间分辨率的叠加力跟踪(ms)。在这里,可以评估斑蝥素与用药前值相比的作用力增加(Ctr)。C:在高时间分辨率(mN/ms)下,力对时间的一阶导数叠加的原始记录。在这里,与用药前的值相比,斑蝥素对时间的正和负一阶导数(dF/dt)的增加被绘制出来。总结了斑蝥素对收缩力(D)、张力峰值时间(E: T1)和松弛时间(E: T2)、张力发展速率(F: dF/dtmax)和张力松弛速率(F: dF/dtmin)的影响浓度-反应曲线。*与CTR比较p < 0.05,与isop < 0.05。坐标A和B:收缩力,单位为毫牛顿(mN)。坐标为A,坐标为B。C和D的坐标以毫秒为单位。收缩率和弛豫率,单位为E mN/s。横坐标表示负十进浓度的斑蝥素浓度。A中的横杠表示时间轴,单位为分钟。与对照组(CTR;用药前价值)用星号表示。“n”表示实验次数

与有节奏左心房准备的观察结果相似,斑蝥素也增强了自发跳动右心房准备的收缩力。这可以从低速度的原始记录(图3A,图3B)和高速度的原始记录(单次收缩的描记图,图3B)中看到,证明斑蝥素在右心房准备中是活跃的。与左心房制剂的作用类似,斑蝥素没有改变张力峰值时间和松弛时间(图3E),但斑蝥素增加了张力发展的速度和松弛的速度,这可以从图3C的原始记录和图3F的总结中看出。这些观察结果与我们之前对豚鼠分离的自发心跳右心房制剂的研究数据相似(Neumann et al. 1995a, b)。值得注意的是,斑蝥素并没有增加右心房制剂的心跳率。这可以从图4A所示的原始记录中观察到。可以认为,我们的系统对检测心跳率的变化不够敏感。然而,这种解释我们的发现是不太可能的,因为额外的异丙肾上腺素应用于这些右心房制剂样品提高了自发心跳率。图4B总结了几个这样的实验。此外,我们还研究了斑蝥素对异丙肾上腺素正性肌力作用的影响。结果表明,经30µM斑斑素预处理左心房制剂后,异丙肾上腺素对左心房的浓度响应曲线由(- lg ec50值)7.44±0.07移动至8.53±0.46 (n = 3-4, p < 0.05)。

图3
figure 3

斑蝥素增加小鼠右心房收缩力。A:电刺激右心房准备中发展张力的原始记录,B:原始记录:以毫秒为单位的高时间分辨率叠加力描记。这里,将100µM斑斑素增加的力与药物前值(Ctr)进行比较。c:在高时间分辨率(mN/ms)下,力对时间的一阶导数的原始记录叠加跟踪。D:斑蝥素对收缩力、张力峰值时间(E)、松弛时间(E)、张力发展速率(F: dF/dtmax)和张力松弛速率(F: dF/dtmin)影响的浓度响应曲线。* p < 0.05 vs. Ctr, # p < 0.05 vs. isooprenaline。3A和3B中的纵坐标:收缩力,单位为毫牛顿(mN)。在mN中以3A为坐标。三维纵坐标为对照组的百分比(Ctr:未添加药物:1.40 mN±0.45 mN)。3E的坐标单位是毫秒(ms), 3F的坐标单位是mN/ms。在3C和3F的收缩速率和弛豫速率mN/s。横坐标表示负十进浓度的斑蝥素浓度。A中的横杠表示时间轴,单位为分钟。与对照组相比有显著差异(Ctr;用药前价值)用星号表示。“n”表示实验次数

图4
figure 4

斑蝥素不会增加心跳速率。A:斑蝥素(cantharidin, CANT)对心率(bpm纵坐标)随时间(min,横坐标)的影响的原始记录。最后反复清洗样品并加入异丙肾上腺素。为了比较异丙肾上腺素的效果。B:纵坐标:对照组的汇总值(Ctr:未加药:392 bpm±31.4 bpm)。“n”表示实验次数。Ctr:用药前值。横坐标:加入斑蝥素浓度或相应体积的溶剂。为了比较异丙肾上腺素的效果。* p < 0.05 vs. Ctr, # p < 0.05 vs.异丙肾上腺素(Iso)

为了进一步了解小鼠心房中这些机械反应的生化机制,我们研究了斑蝥素是否会增加小鼠心房中的心脏磷酸化。因此,在图2A所示的收缩实验结束时,我们冷冻小鼠心房样本并进行Western blotting。很明显,10µM斑蝥素增加了小鼠心房中磷蛋白的磷酸化状态(图5),这与我们之前在豚鼠心室心肌细胞上的发现相似(Neumann et al. 1995a, b)。更详细地说,我们量化了任意数量的感兴趣蛋白的磷酸化状态,并将每个值除以同一蛋白通道钙调磷酸酶的表达。通过这一归一化,我们发现100µM斑斑素使PLB在16号氨基酸的磷酸化状态从0.57±0.17增加到4.27±0.42 (n = 3,各p < 0.05),使肌球蛋白轻链20的磷酸化状态从0.87±0.22增加到5.40±1.13 (n = 3,各p < 0.05)。

图5
figure 5

斑蝥素增加小鼠心房磷酸化。斑蝥素增加离体小鼠心房磷酸化。如图2所示的收缩制剂被冷冻夹紧。典型的免疫印迹图用箭头表示磷蛋白。作为加载对照,我们通过切断印迹的通道,用不同的一抗孵育下半部和上半部来评估calsequestrin (CSQ)的蛋白表达。指示斑蝥素(cantharidin)的浓度。分子量标记用箭头表示,用千道尔顿(kDa)表示。

在详细研究了斑蝥素在小鼠心房制剂中的机械和生化作用之后,考虑对人类心房制剂进行类似的研究似乎更具有临床意义。由于我们已经发表了一项关于斑蝥素在衰竭和非衰竭人类心室肌条中的收缩作用的研究(link et al. 1996),一个主要的悬而未决的问题是斑蝥素如何在人类心房制剂中起作用。具体来说,斑蝥素在人类心室中的作用和在小鼠心房中的作用一样强还是更弱?从本质上讲,我们将寻找斑蝥素在小鼠和人类中作用的物种或地区特异性差异。

与小鼠心房的发现相似,我们还观察到斑蝥素以浓度和时间依赖性的方式增加了人类心房的收缩力,如图6A所示的原始记录所示。斑斑素在人类心房中的浓度高于小鼠心房(图2D),但在人类心室中观察到的浓度相似(link et al. 1996)。这些正性肌力效应的数据被绘制为人类心房的单次快速收缩(图6B)。收缩力的增加伴随着松弛速率和张力发展速率的增加,如图6C所示的原始记录所示,在图6F所示的汇总数据中也可以看出。斑蝥素的正性肌力作用在30µM及更高浓度的人右心房制剂中变得显著(图6D)。斑斑素(300µM)在提高人右心房收缩力方面的效果不如异丙肾上腺素(1µM)(图6A, 6D)。此外,斑蝥素虽然不能缩短人心房的张力峰值时间,但却缩短了人心房的松弛时间(图6),这与我们在前人研究中对人心室的观察结果相似(link et al. 1996)。此外,我们还研究了斑蝥素对异丙肾上腺素正性肌力作用的影响。结果表明,100µM斑斑素对人右心房制剂的预培养使异丙肾上腺素的浓度响应曲线由(- lg ec50值)8.42±0.16左移至9.35±0.20 (n = 3-4, p < 0.05)。

图6
figure 6

斑蝥素增加人体心房的力量。A:斑蝥素浓度和时间依赖性正性肌力作用的原始记录,单位为毫牛顿(mN,纵坐标)(min,横杆)。在一些实验中,样品在液氮中快速冷冻以测量蛋白质磷酸化。注意,与异丙肾上腺素相比,力的增加是缓慢的。在一些样本中,我们注意到典型的收缩性舒张张力的增加。在一些样品中,我们在实验结束时向器官浴中加入1µM异丙肾上腺素以测试效率。B:以毫秒为单位的高时间分辨率叠加的原始录音。这里,斑蝥素增加的力量与非刺激收缩(CTR)相比。请注意,与CTR相比,斑蝥素在增加力量的同时也缩短了放松时间。为了比较异丙肾上腺素的效果。C:收缩力,D:张力峰值时间(T1), D:弛豫时间(T2), E:收缩速率(dF/dtmax), E:弛豫速率(dF/dtmin)。*与CTR比较p < 0.05,与isop < 0.05。坐标6A和6B:以毫牛顿为单位的收缩力(mN)。在mN中6a, 6B, 6C和6D的坐标。坐标6E,单位是毫秒(ms)。收缩速率和弛豫速率(6F mN/ms)。附图表明斑蝥素在负十进浓度下的浓度。A中的横杠表示时间轴,单位为分钟。与对照组的显著差异(CTR;用药前价值)用星号表示。“n”表示实验次数

很明显,100µM斑斑素增加了人心房中磷蛋白(PLB)的磷酸化状态,肌钙蛋白(Tnl)和肌球蛋白轻链20 (MLC20)的抑制亚基(图7),这与我们之前使用不同方法对豚鼠心室心肌细胞的研究一致(Neumann et al. 1995a, b)。我们将感兴趣的蛋白的磷酸化状态量化为任意数字,并将每个值除以同一蛋白通道中calsequestrin的表达。使用这个正常化,我们指出,300µM斑蝥素增加了拉钮在氨基酸丝氨酸的磷酸化状态16从0.42±0.09,2.68±0.60 (n = 4,每个,p < 0.05),肌球蛋白轻链的磷酸化状态20从0.88±0.16,5.25±0.83 (n = 4,每个,p < 0.05)和磷酸化状态的交通噪音指数从0.51±0.14,1.24±0.11 (n = 4,每个,p < 0.05)。

图7
figure 7

斑蝥素增加磷酸化。斑蝥素增加离体人心房磷酸化。如图6A所示的收缩制剂被冷冻夹紧。典型的Western blot图用箭头表示磷酸化的磷蛋白、磷酸化的TnI和磷酸化的MLC20。作为加载对照,我们通过切断印迹的通道,用不同的一抗孵育下半部和上半部来评估calsequestrin (CSQ)的蛋白表达。cantharidin (cantharidin)的浓度以微摩尔浓度(µM)表示。分子量标记用箭头表示并标记

讨论

主要新发现

本研究的主要新发现包括斑蝥素的正性肌力作用伴随着人类心房蛋白磷酸化的增加。同样,斑蝥素在小鼠心房中的正性肌力作用和斑蝥素在小鼠心房中存在的蛋白磷酸化增加也未被报道。

斑蝥素的作用机制

我们的假设是,与其在人类心室中的作用类似,斑蝥素也抑制人类心房中PP1和/或PP2A的活性。我们之前已经证明,在mRNA和蛋白质水平上,PP1和PP2A的催化亚基存在于人类心房中(l ss等人,2000);因此,斑蝥素靶点存在于人类心房。斑斑素在体外抑制人类心脏中PP1和PP2A的效力非常相似,因此本研究中的实验不允许我们区分PP2A和PP1在人类心房制剂中关于收缩力增加的功能作用(Neumann et al. 1995a, b;Knapp et al. 1998a, b;Neumann et al. 1999)。数值上,斑蝥素对PP2A的抑制作用略强于PP1 (Neumann et al. 1995a, b);然而,这并不支持低浓度斑蝥素的正性肌力作用是由于抑制PP2A,而高浓度斑蝥素的正性肌力作用是由于抑制PP1的解释。显而易见的是,PP1和PP2A各占人类心脏中PP活性的45%左右;加起来,它们约占人类心脏中PP活性的90% (Herzig和Neumann 2000)。因此,我们有理由推断斑蝥素是通过协同抑制PP1和PP2A而起作用的。因此,斑蝥素至少增加了磷蛋白、TnI和MLC20的磷酸化。我们之前的研究表明,与斑蝥素孵育可以增加放射性标记的豚鼠心室心肌细胞中许多蛋白质的磷酸化(Neumann et al. 1995a, b)。同样清楚的是,人类磷蛋白可以被PP1和PP2A去磷酸化(Neumann et al. 1999)。之前,我们对32p标记的豚鼠心肌细胞的干燥放射性凝胶进行放射自显像,以检测斑斑素诱导的蛋白质磷酸化(Neumann等,1995a, b)。我们目前的多细胞人(或小鼠)心房制剂方案不使用放射性标记的蛋白质;它使用磷酸化特异性抗体。这种方法的优点是确保在实验室中不使用放射性。然而,缺点是我们无法追踪人类心房中蛋白质磷酸化的完整模式。

调控蛋白磷酸化的作用

一般的假设是,磷蛋白的磷酸化可以解释哺乳动物心脏受到β-肾上腺素能刺激后,心肌弛豫时间缩短和紧张弛豫速率增加。这是因为Ca2+通过sarco/内质网Ca2+- atp酶(SERCA)迅速运输回肌浆网(SR),并且由于SR中现在有更多的Ca2+,下一次心跳可以从SR释放更多的Ca2+(图1)。因此,磷蛋白磷酸化被认为也有助于斑斑素的正性肌力作用和斑斑素存在下张力发展速度的增加(Boknik等人,2001)。在膜片钳实验中,斑蝥素在分离的豚鼠心室心肌细胞中增加了流过l型Ca2+通道的电流,这种电流的增加是通过camp依赖性磷酸化实现的(Neumann et al. 1995a, b, Boknik et al. 2000)。一般认为,磷酸酶在人心房心肌细胞l型Ca2+通道去磷酸化中的作用不仅与PP1和/或PP2A有关,还与钙调磷酸酶(PP2B)有关。因此,我们假设斑蝥素也会增加小鼠和人类心房的电流;然而,这还需要通过进一步的实验来证实。值得注意的是,MLC20磷酸化的增加需要解决。磷酸酶抑制剂增加MLC20的磷酸化状态并不意外。在之前的研究中,我们使用放射性方法检测到在斑蝥素存在的情况下,豚鼠心室心肌细胞中MLC20的磷酸化状态增加(Knapp et al. 1998a, b),以及另外两种研究得很好的磷酸酶抑制剂存在的情况:calyculin A (Neumann et al. 1994;Neumann et al. 1995a, b)和冈田酸(Neumann et al. 1993)。本研究未使用花青素A和冈田酸,因为用于器官浴实验(体积为10 ml)的采购成本过高。

MLC20磷酸化的特殊作用

MLC20在体内和体外都不是PKA的底物。在体内,通过异丙肾上腺素刺激PKA可导致豚鼠灌注心脏和豚鼠心室心肌细胞中磷蛋白和TnI磷酸化状态的增加。MLC20在平滑肌细胞中被广泛研究。一项研究清楚地表明,MLC20通常被MLC激酶磷酸化,而不是被PKA磷酸化;有数据显示,MLC20可被PP1和PP2A去磷酸化(Chang et al. 2016;Sheikh et al. 2015;Kitazawa et al. 2021)。

根据我们之前放射性标记心肌细胞的数据(Neumann et al. 1995a, b),我们预测,使用针对其他抗原的其他磷酸化特异性抗体或使用磷酸化特异性质谱方法,将在斑蝥素培养的人心房中检测到更多的磷酸化蛋白。

物种的差异

值得注意的是,斑蝥素在增加小鼠心房收缩力方面比在人心房更有效。这一发现也可能支持斑蝥素通过抑制磷酸酶增加收缩力的假设。在豚鼠心脏制剂中(Neumann et al. 1995a, b),与小鼠心脏制剂一样,斑蝥素在增加收缩力方面比在人心室制剂中更有效;与这些机制观察一致,斑蝥素对豚鼠心室匀浆中磷酸酶活性的抑制作用强于人类心室匀浆(Neumann et al. 1995a, b)。

对跳动速率的影响

关于我们在小鼠右心房制剂上的发现,一些作者已经提供了良好的数据,尽管是在兔窦结细胞上,磷酸化-尤其是磷蛋白-对于窦结细胞β-肾上腺素能刺激后心跳率的增加是必要的(回顾:Vinogradova和Lakatta 2021)。我们在小鼠(在本研究中提出)和豚鼠(Neumann et al. 1995a, b)上的数据与他们的数据不一致,因为我们没有发现斑蝥素增加心跳速率,这很可能是由于物种差异。此外,支持或反驳我们关于斑蝥素在人窦结细胞中的数据将是至关重要的;然而,这超出了本研究的范围。此外,与其他研究人员一起,我们已经产生了过度表达,敲除或敲除心脏磷酸酶的小鼠。根据我们在本研究中提出的小鼠的初步数据,通过在这些产生的转基因小鼠中研究斑蝥素可能有助于验证我们的假设。我们目前正计划对我们的转基因模型进行这样的研究。

临床意义

我们目前的数据证实并扩展了我们之前的数据,即磷酸酶抑制可能是心力衰竭的一种潜在治疗方式。然而,正如我们在先前的研究中所显示的,斑蝥素可诱导离体动物冠状动脉肌条的血管收缩(Knapp等,1997;Knapp et al. 1998a, b)和人类冠状动脉肌条(Knapp et al. 1999)。因此,斑蝥素在人体中会增加心肌的收缩力;而斑蝥素会同时减少甚至停止冠状动脉灌注。因此,有机化学家现在仍然需要合成心肌细胞特异性磷酸酶抑制剂,这种抑制剂可以在不减少冠状动脉血流或损害其他器官的情况下增加收缩力。在这项研究基础上进一步研究的另一个警告是,老鼠和人类在斑蝥素方面的物种差异。我们提交的观察结果仍然表明斑蝥素在增加小鼠心脏制剂中的收缩力方面比在人类心脏制剂中更有效。这表明新的PP抑制剂必须在人体组织中进行测试,可以想象,在目前来源于人类心肌细胞的干细胞中。

本研究的局限性

我们没有测量人类左心室的磷酸化。人的左心室比人的右心房对力的产生更重要。遗憾的是,我们目前无法获得人类心室样本。此外,可以认为我们没有测量人类心肌细胞的磷酸化。可以想象,斑蝥素不仅可以抑制心肌细胞中的PP,还可以抑制人体心脏中的其他细胞,如内皮细胞或平滑肌细胞。这当然是MLC20的一种可能性,因为MLC20不仅发生在心肌细胞中,也发生在其他细胞类型中。然而,我们认为磷蛋白和TnI是心肌细胞特异性蛋白;因此,它们磷酸化的增加很可能是由于斑蝥素抑制心肌细胞中的PP。仔细观察人心肌细胞的原始记录,可以观察到斑蝥素浓度为100µM和300µM时收缩力的短暂下降。我们推测,收缩力的这种短暂下降是由于所使用的溶剂。我们在DMSO中使用100mm斑蝥素原液。因此,人类样本需要比小鼠心房更多的斑蝥素来增加收缩力。因此,人的心房也比小鼠的心房接受了更多的DMSO。我们在之前的一项研究中观察到斑蝥素溶解在DMSO中的人类心脏组织(心室)收缩力的下降(link et al. 1996)。

综上所述,我们验证了引言中提出的假设如下:(1)斑蝥素增加了人类心房中重要调节蛋白的磷酸化。(2)斑蝥素增加人体心房收缩力。(3)斑蝥素增加人心房的松弛,这可能是由于磷蛋白和Tnl的磷酸化增强。



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