2023-10-18 22:30

中国甘肃苯丙酮尿患者苯丙氨酸羟化酶变异谱及基因型-表型相关性

摘要

背景

苯丙酮尿症(PKU)是一种常见的先天性常染色体隐性代谢疾病,由苯丙氨酸羟化酶(PAH)变异引起。

方法

通过Sanger测序、多重连接依赖探针扩增和全外显子组测序对967例中国甘肃的PKU患者进行基因分型。我们分析了多环芳烃外显子的变异、它们的侧翼序列和内含子。

结果

PAH基因深层内含子变异的检测可显著提高PKU的遗传诊断率。PKU亚型间多环芳烃变异的分布可能与甘肃地区独特的遗传背景有关。

结论

多环芳烃热点变异的鉴定将有助于开展大规模新生儿PKU遗传筛查。本研究中发现的五种新的多环芳烃变异进一步扩大了多环芳烃变异谱。基因型-表型相关分析有助于预测PKU患者的预后,从而制定精确的治疗方案。

介绍

苯丙酮尿症(Phenylketonuria, PKU, OMIM:261600)是最常见的先天性常染色体隐性代谢疾病,由染色体12q23b[1]上苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因的纯合或复合杂合突变引起。PKU的患病率在世界各地的种族和地理区域之间存在显著差异。在美国,PKU的发病率约为1:10 000活产婴儿。在欧洲,芬兰的PKU发病率相对较低,为1:11万2千名活产婴儿;然而,在俄罗斯卡拉恰伊-切尔克斯共和国,新生儿的发病率为1:8 0,卡拉恰伊国民的发病率为1:32 0。在亚洲,日本和泰国的PKU发病率相对较低[5,6]。在中国,PKU的平均发病率为15,924 [7];然而,在中国,甘肃省的发病率最高,为1/3420[8]。

PKU根据表型可分为三种亚型:轻度高苯丙氨酸血症(MHP);血苯丙氨酸(Phe)浓度120 ~ 360 μmol/L;建议定期随访,但不需要治疗);轻度苯丙酮尿症;血Phe浓度60 ~ 1200 μmol/L),典型苯丙酮尿症(cPKU);血Phe浓度≥1200 μmol/L)。mPKU和cPKU患者需要饮食治疗[9,10]。未经治疗的PKU患者可发展为全面发育迟缓或严重的不可逆转的智力残疾,以及生长衰竭、色素减退、运动缺陷、共济失调和癫痫发作。低PKU筛查和治疗率会影响患者的生活质量和婴儿死亡率[12,13]。因此,早期筛查、基因诊断和治疗对于减少PKU对患者造成的损害非常重要。

研究多环芳烃变异谱有助于筛查高危人群,提供产前诊断和产前遗传咨询。截至2022年11月2日,PAHvdb数据库(http://www.biopku.org/home/pah.asp)整理了1583个PAH变体,包括错义、移码、同义、剪接、未翻译区和大规模缺失变体。全基因组测序技术的临床应用导致越来越多的致病性深层内含子变异(距离外显子-内含子边界超过100 bp)被发现。深内含子多环芳烃变异的致病性分析提高了PKU[14]的诊断率。

在这项研究中,我们对来自中国西北甘肃省的967个PKU家庭进行了PAH的外显子和内含子变异分析。研究结果可为PKU患者家属的后续治疗、遗传咨询和产前遗传咨询提供参考。此外,研究PAH的分子遗传学也可以为改善PKU的筛查和诊断措施提供基础数据。

材料与方法

DNA样本

根据临床特点和新生儿筛查,2012年1月至2021年12月在甘肃省妇幼保健院医学遗传学中心诊断出967例PKU。其中cPKU 407例,mPKU 403例,MHP 157例。这项研究是根据1975年《赫尔辛基宣言》及其后来的修正案的原则进行的。本研究方案经甘肃省妇幼保健院伦理委员会批准。从所有研究参与者或其法定监护人处获得书面知情同意。

基因组DNA制备

使用天根DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech, China)从患者及其父母的外周血样本(2-3 mL)中提取基因组DNA。使用NanoDrop 2000 (Thermo Fisher, USA)对DNA质量和定量进行评估。

桑格测序

利用primer Premier 5.0软件(Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, US)[13]设计了13对PCR引物,分别针对PAH的外显子和侧翼序列。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上纯化,然后在ABI 3500DX遗传分析仪(应用生物系统)上使用BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒(美国应用生物系统公司)进行双向测序。

全外显子组测序和生物信息学分析

全外显子组测序使用Agilent SureSelect Human All Exon V6 Kit (Agilent Technologies Inc., USA)在Illumina NovaSeq 6000平台(Illumina Inc., CA, USA)上进行。使用Pgenomics软件(https://www.pgenomics.cn/)进行数据分析和变异整理。根据人类基因组变异学会(www.hgvs.org/)推荐的命名法描述变异。变异频率在GnomAD (http://gnomad.broadinstitute.org/)、Exome Sequencing Project (ESP,http://evs.gs.washington.edu)和SNP (dbSNP) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/snp)数据库中搜索。候选变异通过Sanger测序在每个家庭的父母中得到确认。

大规模删除/重复分析

根据制造商的协议,使用SALSA MLPA P055 PAH试剂盒(MRC Holland, Netherlands)进行大规模缺失/重复PAH变异的检测。使用Coffalyser软件(MRC Holland, Netherlands)分析多环芳烃外显子的拷贝数变化。

统计分析

采用SPSS 22.0软件(IBM Corp., America)进行统计分析。采用χ2检验分析各致病突变位点在不同PKU亚型间的分布差异。经Bonferroni校正,p < 0.05为差异有统计学意义。


目录


相关的内容
摘要
介绍
材料与方法
结果
讨论
数据和材料的可用性
参考文献
致谢

作者信息
道德声明



相关的内容

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结果

本研究967例PKU患者中,cPKU 407例,mPKU 403例,MHP 157例。在1934个等位基因中检测到1909个变异,检出率为98.70%。cPKU家族检出率为100%,mPKU家族检出率为98.88%,MHP家族检出率为94.90%。MHP的基因诊断率为89.81%,mPKU为98.01%,cPKU为100%,967例PKU患者的基因诊断率为97.52%(表1)。

表1 PKU患者基因诊断率

967例PKU患者中943例检测到2个等位基因变异,23例仅检测到1个杂合变异,1例未检测到明确或疑似PAH基因变异。对PKU患者中检测到的所有变异进行家长来源验证。943例患者的变异均来自父母。943例明确遗传诊断的PKU患者中,879例由复杂杂合变异体引起,64例由纯合变异体引起。

在967例患者中检测到的1909个等位基因变体由185个不同的变体组成。其中最常见的是c.728G > A,其次是c.611A >g, c.721C >t, c.1068C >a, c.442-1G >a。前22个热点突变的累积频率达到70.9%。在182个变异中,c.160_163delTTAT、c.305T >a、c.376C >t、c.599C > T、c.694_696delCAGinsTAA是新的变异,未在ClinVar或HGMD数据库中报道。根据美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)指南,将c.160_163delTTAT、c.376C >t、c.694_696delCAGinsTAA归为致病性,其证据为PVS1、PM2、PM3、c.305T > A和c.599C > T可能致病性,证据为PM1、PM2、PM3、PM5(表2)。

表2新变异的致病性分析多环芳烃 (NM_000277)

在PKU患者中检测到的185个变异中,错义变异120个,占64.86%,剪接变异28个,占15.14%,无义变异19个,占10.27%(表3)。在外显子/内含子水平上,外显子7中检测到的变异最多(27个),其次是外显子11,然后是外显子12(表4)。在检测到的1909个等位基因中,外显子7中检测到的等位基因数量最多,为570个;其次是外显子11,然后是外显子12(表4)。虽然在内含子4中只检测到两个变体,但等位基因的数量高达83个。Sanger测序检测PAH变异时,通过对6、7、11、12外显子及其侧翼的扩增测序,可以检测到71.9%的突变位点(表5)。

表3多环芳烃基因变异类型
表4多环芳烃基因变异分布
表5 .所覆盖的等位基因数量多环芳烃基因外显子及其侧翼序列

等位基因频率大于或等于10的PAH变异有40个。以下23个位点的分布差异的三个北大亚型Bonferroni调整后达到统计学意义:c.728G >, c.611A > G, c.721C > T, c.1068C >, c.442-1G >, c.1238G > C, c.1197A > T, c.842 + 2 T >, c.331C > T, c.158G >, c.208_210delTCT, EXUp_1del, c.782G >, c.1199G >, c.1301C >, c.764T > C, c.1256A > G, c.740G > T, c.526C > T, c.1252A > C, EX1-1del, c.1174T > A和c.472C > T。C . 1199g > A、C . 1301c > A、C . 764t > C、C . 740g > T、C . 526c > T、C . 1222c > T、C . 498c > G、C .168 + 5G > C、C . 472c > T和C . 722delg变异位点仅在mPKU和cPKU中检测到,而在MHP中未检测到,说明这些位点更容易引起mPKU和cPKU。

根据三种PKU亚型间分布差异有统计学意义(均p < 0.001)的23个变异位点频率,将位点频率最高或最低的PKU亚型作为实验组,其余两组作为对照组。的分布频率c.728G >, c.1068C >, c.442-1G >, c.331C > T,和c.764T > C cPKU组高于民族主义者行动党(MHP) + mPKU组(p < 0.005,表6)。的分布频率c.721C > T, c.208_210delTCT, c.1301C >,和c.1252A > C mPKU组高于民族主义者行动党(MHP) + cPKU组(p < 0.007,表6)。的分布频率c.158G >, c.1256A > G和c.1174T >在民族主义者行动党(MHP)高于mPKU + cPKU组(p < 0.008,表6)。

表6 .分布差异比较多环芳烃基因型和PKU亚型

此外,我们发现64例由纯合变异体引起的PKU,共检测到23个变异体,其中MHP 2例,mPKU 10例,cPKU 14例(表7)。纯合变异体引起的MHP只有2例,为c. 721c > T/c。721C > T和c. 158g > A/c。c. 728g . > A是最常见的纯合突变,在13例mPKU和17例cPKU患者中(表7)。721C > T纯合突变导致2例mPKU,但在cPKU中未发现该位点纯合突变的患者(表7)。cPKU也由EX3del、EX1-2del和EX1-1del大纯合缺失引起。此外,在cPKU患者中发现了C .442- 1g > A和C . 1238g > C的纯合性,而在MHP或mPKU患者中则没有(表7)。

表7纯合变异PKU患者变异位点分布

讨论

高苯丙氨酸血症是世界上最常见的氨基酸代谢遗传性疾病。PKU是高苯丙氨酸血症的主要类型,是由编码苯丙氨酸羟化酶[15]的PAH基因突变引起的常染色体隐性遗传病。三种PKU亚型的分布存在区域差异。北大在爱沙尼亚的比例最高,为93.5%,其次是斯洛伐克的72.6%,而中国北大的平均比例为62.1%。本研究中,cPKU占PKU患者的42.09%,明显低于国内平均比例。这可能与甘肃省人群独特的遗传背景有关。

多环芳烃的变异广泛分布于基因的外显子、内含子以及上游和下游非翻译区。在撰写本文时,PAHvdb数据库包含1583个变体。通过分析PAH的外显子和内含子,我们在967例PKU患者中鉴定出185个变异。其中最常见的是错义变异,其次是拼接变异和无义变异。除了内含子1、3和5外,它们分布在整个基因中。外显子7等位基因最多,其次是外显子11、12、6、3,内含子4和外显子5,说明上述区域是PAH变异的热点区域。然而,其他研究报道了欧洲PKU患者的PAH热点位于外显子12和内含子11b[16],这表明PAH变异位点的分布因种族而异。

在本研究检测到的185个PAH变异中,等位基因频率最高的是c.728G > A(15.40%),其次是c.611A > G(5.08%)、c.721C > T(4.87%)、c.1068C > A(4.77%)、c.442-1G > A(4.19%)。c.1238G > C(4.03%)、c.1197A > T(3.61%)、c.842 + 2 T >(3.35%)、c.331C > T(3.25%)和c.158G >(2.88%)。Li等人对796例中国PKU患者进行基因分型后发现,PAH的高等位基因频率位点为C . 728g > A(17.53%)、C . 611a > G(7.66%)、C . 1197a > T(5.84%)、C . 721c > T(5.4%)、C . 331c > T(4.77%)、C . 1068c > A(4.46%)、C . 1238g > C(4.33%)和C .442-1 G > A(3.77%)。Wang等人对808例中国PKU患者的研究中,高频PAH等位基因为C . 728g > A(17%)、p.Y204_T236delinsS(7.4%)、C . 721c > T(7.2%)、p.W356Efs*22(5.4%)、C . 331c > T(4.4%)、C . 1068c > A(3.9%)、C . 1238g > C(3.8%)和C .442- 1g > A(3.7%)。c.842 + 2T > A等位基因频率较高,c.331C > T等位基因频率较低。这表明中国不同地区多环芳烃等位基因的频率存在区域差异。

三种不同类型PKU患者基因变异检出率和诊断率存在显著差异。mPKU和cPKU的诊断率明显高于MHP[19,20]。本研究967例PKU患者中,致病等位基因检出率为98.70%,MHP、mPKU和cPKU的诊断率分别为89.81%、98.01%和100%。本研究中PKU患者的等位基因检出率及三种PKU亚型的基因诊断率均高于既往研究[18、19、20、21、22、23、24、25、26]。这是因为我们分析了多环芳烃的深层内含子。通过检测PAH中深层内含子突变,对22例PKU进行了遗传诊断,进一步提高了PKU患者的遗传诊断率;然而,仍有4.8%的PKU患者没有得到明确的基因型诊断。这可能是因为一些非多环芳烃基因,例如,DNAJC12可能影响多环芳烃的功能,从而增加血液中Phe浓度[27],或者是因为表观遗传因素[28]。研究表明,长非编码rna Pair和人类HULC与多环芳烃相关,并通过促进多环芳烃底物和多环芳烃辅助因子相互作用来调节酶活性[29,30]。

大量PAH变异保留了不同程度的PAH活性,这些酶活性的差异对应着不同的PKU表型[31,32]。因此,研究PKU致病性多环芳烃变异谱对于明确PKU基因型与临床表型的关系,为PKU的治疗、生育指导、遗传咨询和产前诊断提供依据具有重要意义[10]。此外,从PAH基因型预测PKU的表型可能具有非常重要的临床价值,特别是在治疗临界血Phe浓度患者和对患者家属进行遗传咨询方面。

我们发现cPKU组PAH基因座C . 728g > A、C . 1068c > A、C .442- 1g > A、C . 331c b> T、C . 764t > C的分布频率高于MHP + mPKU组(均p < 0.005,表6),说明这些基因座是cPKU的主要致病变异。C . 721c > T、C . 208_210deltct、C . 1301c > A、C .1252a > C在mPKU组的分布频率高于MHP + cPKU组(均p < 0.007,表6),这些位点是mPKU的主要致病变异。c.158G > A、c.1256A > G和c.1174T > A在MHP中的分布频率高于mPKU + cPKU组(均p < 0.008,表6),这些位点是MHP的主要致病变异。C . 1199g > A、C . 1301c > A、C . 764t > C、C . 740g > T、C . 526c > T、C . 1222c > T、C . 498c > G、C .168 + 5G > C、C . 472c > T和C . 722delg是mPKU和cPKU的主要致病变异,在MHP中未检出(表6)。

MHP 1例,mPKU 2例(无cPKU),均由c. 721c > T/c引起。721C >t纯合性。两例mPKU患者血Phe分别为363 μmol/L和366 μmol/L。因此,我们推测c.721C > T与MHP和轻mPKU有关。在13例mPKU和17例cPKU中发现c.728G > A的纯合性,进一步说明c.728G > A在该区域的携带率较高,且与mPKU和cPKU相关。cPKU也是由大片段纯合缺失引起的,包括EX3del、EX1-2del和EX1-1del。C .442- 1g > A或C . 1238g > C纯合的患者也出现cPKU。因此,我们推测这些位点也是cPKU的主要致病变异位点。

建立PKU基因热点突变数据库将有助于建立快速、高效、低成本的基因分型方法。这些可用于快速评估PKU患者,以便及时预防和干预治疗。它们也可用于新生儿筛查和孕前人群中的携带者筛查。目前市面上有很多用于筛查耳聋基因热点突变的试剂[33,34,35,36]。然而,目前临床还没有筛查PKU中PAH热点突变的检测试剂盒,不利于PKU患者的早期筛查和诊断。

在本研究中,我们发现超过70%的PKU患者通过筛选前22个PAH热点突变被检测出来。因此,可以进行大规模的新生儿筛查,以识别超过70%的PKU患者。对PAH的6、7、11、12外显子进行PCR-Sanger测序,PKU突变位点在甘肃地区的检出率大于70%,可用于PKU的初步诊断。

综上所述,本研究是中国单一地区样本量最大的PKU基因型表型研究,我们对PAH进行了深度内含子变异检测,可以提高PKU的基因诊断率。多环芳烃热点变异有可能为大规模新生儿遗传筛查提供基础数据。本研究发现的五种新的多环芳烃变异进一步扩大了多环芳烃变异谱。基因型-表型相关性分析将有助于预测PKU患者的表型和个性化治疗的定制。



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