2023-10-18 22:30

雾化器对α -1抗胰蛋白酶肺输送的有效性

摘要

对于患有α -1抗胰蛋白酶(AAT)基因缺陷(AATD)的患者来说,肺内雾化给药可能是肠外输注的一种有趣的替代方法。在蛋白质治疗的情况下,雾化模式和速率对蛋白质构象和活性的影响必须仔细考虑。本文采用喷射式和网状振动系统两种类型的雾化器对一种输注用AAT商用制剂进行雾化,并进行了比较。研究了AAT体外雾化后的雾化性能,包括质量分布、可吸入组分、给药效率,以及AAT体外雾化后的活性和聚集状态。这两个雾化器演示等效雾化性能,但网状雾化器提供了更高的效率,在剂量的交付。两种喷雾器都可以很好地保存蛋白质的活性,并且没有发现聚集或其构象的变化。这表明AAT雾化是一种合适的给药策略,可用于临床实践,将AATD患者的蛋白质直接输送到肺部,无论是作为肠外给药的支持治疗,还是用于过早诊断的受试者,以预防肺部症状的发生。

图形抽象

介绍

α -1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)是一种遗传性疾病,使受影响的个体易患肝脏和肺部疾病。AATD源于SERPINA-1基因的突变,该基因编码α -1抗胰蛋白酶(AAT), AAT是一种糖基化的丝氨酸蛋白,主要在肝脏产生,是血浆[1]的主要成分之一。AATD的肝脏表现主要是由于AAT错误折叠导致细胞内聚集物的形成。相反,肺相关疾病与功能低下或无功能的AAT变异相关,这些变异不能充分抑制中性粒细胞弹性酶(NE),一种作为细胞内和细胞外杀微生物剂的丝氨酸蛋白酶。较高的NE活性导致肺弹性蛋白的蛋白水解,并在长期内导致肺气肿和支气管扩张[1]。

目前治疗AATD的方法是每周缓慢静脉注射从人血浆中纯化的AAT,以恢复约60 mg/dL的血浆保护水平。注射费用昂贵,需要门诊治疗和医护人员。此外,尽管肺是AATD的主要影响器官,但据报道只有3%的静脉注射AAT到达肺上皮[3]。因此,如果一定量的活性AAT以活性形式到达下呼吸道,则AAT的局部管理被认为是一种潜在的替代方案。这个想法在AAT治疗领域并不新鲜:在过去,AAT已经通过喷射喷雾器雾化给健康志愿者b[4],囊性纤维化患者[5]和AATD患者[6]。

目前市场上用于慢性疾病的雾化产品通常在处方时使用推荐的雾化器,因为吸入剂量可能因雾化系统的不同而有很大差异。事实上,吸入药物是真正的药物/器械组合产品。在蛋白质治疗方面,还应考虑雾化方式和速率对蛋白质构象和活性的影响。事实上,由于与气液界面、氧化、热降解和机械应力的相互作用,治疗蛋白可能会变性,从而失去其活性。Flament等人[8,9]为AAT解决了这些问题,他们重点研究了配方辅料和工艺参数对喷射和超声雾化系统雾化的影响。在这些研究中,表面活性剂的加入提高了AAT的可吸入分数,但雾化器的类型和操作条件起了主要作用。21世纪初,振动网喷雾器的出现消除了溶液再循环的问题,为有效雾化药物,特别是生物制药开辟了新的可能性。然而,在雾化过程中,药物溶液发生加热,可能影响耐热性蛋白质。据报道,野生型AAT在48°C左右的温度下会发生变性。此外,据报道,这些类型的雾化器通过界面降解进行蛋白质聚集[7,11]。

研究工作和一些临床试验描述了AAT通过雾化给药来利用其抗炎特性。其中大多数涉及CF患者[12,13,14,15]。所有的结果都同意这种方法的安全性,并为其减少肺部炎症的有效性提供了证据。另一方面,当考虑到AAT患者弹性酶活性的抑制时[16,17,18],有报道称AAT外周高沉积,但临床参数并没有提供确凿的证据表明弹性酶抑制和肺功能的改善,如[19]等文献所述。在我们看来,这些结果受到对雾化时蛋白质的生物活性和聚集的有限考虑的影响,因为对到达深肺的蛋白质剂量的唯一估计不足以保证期望的治疗效果,特别是考虑到所有雾化系统都将蛋白质溶液暴露在潜在的破坏性条件下。

为了解决这些问题,在本文中,我们研究了两种类型的雾化器,即射流和网状振动系统,在体外雾化时,AAT的活性和聚集状态,这是将液体配方高效转化为有效的治疗药物的关键因素。

材料与方法

材料

输注用Prolastin®粉末,含1000mg人血浆纯化AAT (Grifols, Barcelona, Spain, Batch G45BE00351),分成等份,溶解在Arium®净化系统(Sartorius, Goettingen, Germany)生产的超纯水中。将来自A.C.E.F. (Fiorenzuola, Italy)的2.336 g K2HPO4和1.577 g KH2PO4溶于1 L超纯水中,制备25 mM磷酸钾缓冲溶液。Bradford检测试剂盒来自Bio-Rad Laboratories(米兰,意大利)。猪弹性蛋白酶来自Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)。除非另有说明,其他材料均来自Sigma-Aldrich公司。

雾化器和雾化程序

测试了两种市售吸入系统,用于体外评估AAT雾化:一种是呼吸增强喷射雾化器系统TurboBOY®,配备PARI LC Sprint®安瓿瓶,另一种是电子主动振动膜雾化器eFlow®快速装置,均来自PARI GmbH(慕尼黑,德国)。称取适量冻干粉,在超纯水中温和搅拌至最终蛋白浓度为25 mg/mL (2.5% w/v)。6ml蛋白质溶液(即150mg AAT)装入安瓿中用于雾化,以进行输送剂量和空气动力学分布测试。

给药剂量和给药速率的测定

递送剂量(DD)代表发射的蛋白质的总质量,药物递送速率(DDR)代表每分钟发射的质量,以及雾化安瓿中装载的整个剂量所需的时间,根据欧洲药典第11版的规定确定。呼吸模拟器(正弦泵型号SRV500CC, VCS Srl, Parma, Italy)设置为模拟成人呼吸模式15次/分钟,每次吸气潮气量为500 mL。吸入:呼出比为1:1。对于这两种喷雾器,每个安瓿的吸口通过一个特定的橡胶适配器连接到正弦泵,并通过一个过滤器支架(PARI Pharma GmbH,慕尼黑,德国),该过滤器配备了一个过滤器(a /E型玻璃直径76毫米,Pall公司,纽约,美国),以捕获雾化的气溶胶。对于DDR,雾化器运行1 min;然后,将编码为F1的过滤器移除,并替换为新的过滤器(F2),然后启动雾化器并运行直至雾化结束。过滤器F2保留最多5分钟,然后用新的过滤器(F3)替换,以防止破损和过载。射流雾化器雾化结束时间设定为听到溅射后1 min;对于网状喷雾器,其自动停止决定了雾化的结束。

为了估计沉积在过滤器上的AAT的数量,每个过滤器被转移到玻璃结晶器中,在冰冷的25 mM磷酸盐缓冲液中洗涤5分钟,以回收雾化的蛋白质。随后,用孔径为0.45 μm的醋酸纤维素膜过滤,转移至10ml烧瓶中,用冷磷酸盐缓冲液取容,冰存至测定AAT浓度。

通过量化F1收集的AAT的质量来估计DDR,而DD则确定为所有过滤器收集的质量之和。通过布拉德福德测定法(Bradford assay,见下文),用0.5 mL AAT溶液(25mg /mL)吸进过滤器中收集的AAT量,并在10ml冷磷酸盐缓冲液中回收,来评估从过滤器中回收蛋白质的效率。

每个试验都进行了三次。

新一代冲击器测定AAT的质量分布和可吸入分数

用Next Generation impact (NGI, Copley Scientific, Nottingham, UK)分析了两种喷雾器排放的AAT的质量分布。仪器在4°C预冷,以防止液滴蒸发,并在从冰箱中取出冲击器后5分钟内进行测定。通过将仪器连接到由临界流量控制器(TPK, Copley Scientific, Nottingham, UK)控制的泵(VP1000, Erweka, Italy),可以获得15 L/min的连续吸出流量。每个安瓿中装满适量的蛋白质溶液,通过橡胶接头连接到仪器的感应口。按照欧洲药典第11版[20]的规定,激活雾化器4分钟,或2分钟,6分钟或9分钟,或直到安瓿中的溶液耗尽,以及时评估雾化的一致性。用冰冷的磷酸盐缓冲液冲洗微孔收集器的感应口、每一级和过滤器,收集每个样品并在20 ml的容量瓶中取容。每个样品中的蛋白质浓度用Bradford蛋白测定法[21]定量,所得的量(每个阶段回收的量的总和)用于计算发射剂量。利用每个阶段发现的AAT的累积未粒径质量百分比,建立相对于每个阶段截止直径的质量分布图:特别是,根据欧洲药典规范(2.9.18,11版)[20],用Microsoft Excel for Mac (ver. 11)构建,从收集的药物的累积不足百分比(probit scale)相对于每个阶段的对数截止值的图中计算中位数质量空气动力学直径(MMAD)和几何标准偏差(GSD)。16.57)。该图还可以测定细颗粒分数(FPF%),对应于空气动力学直径小于5 μm的液滴中释放的蛋白质的百分比质量。该值还用于估计细颗粒剂量,即预计到达下呼吸道的蛋白质毫克数,作为从DD/DDR实验得出的递送剂量与FPF%之间的乘积。每个试验都进行了三次。

蛋白定量

利用Cary4000分光光度计(Agilent Technologies, Santa Clara, USA)、Bradford assay (Bio-rad Laboratories, Milano, Italy)[21]或12% SDS电泳(SDS- page)[22],然后利用Bio-rad系统对AAT波段进行密度分析,估算每个样品中的AAT量。按照制造商的说明,使用Spark 10 M微孔板阅读器(Tecan, Mannedorf, Switzerland)进行Bradford测定。每次测量一式三份。

AAT活性测定

从DD/DDR试验或NGI试验中获得的样品在液氮中快速冷冻,然后在- 80°C保存,以防止活性随着时间的推移而损失[23]。然后在进行活性测定之前立即解冻。测定每个样品的AAT活性,并将其归一化为其数量,通过SDS-PAGE电泳密度分析确定。简单地说,AAT与10 nM的猪弹性酶在含有0.1 M HEPES, 0.5 M NaCl和0.05% Triton, pH 7.4的溶液中,以5 nM的浓度(SDS-PAGE测定)孵育45分钟。剩余弹性酶活性通过在Cary 4000紫外可见分光光度计下,在410 nM下将n -琥珀酰- ala - ala - ala -对硝基苯胺水解为对硝基苯胺来测定。AAT残余活性分数(A)由无AAT (Vctrl)和有AAT (VI)时弹性酶测定的初始速度计算,根据式1:

(1)

如前所述,通过SDS-PAGE评估蛋白质沉淀[23]。所有的测量都是重复进行的。

e雾化后蛋白质变化的评估

通过动态光散射(DLS)、尺寸排除色谱(SEC)和圆二色性(CD)评估雾化后的蛋白质聚集和结构完整性。为了防止从过滤器中回收的任何蛋白质改变,如在DD/DDR实验中,根据欧洲药典规范(2.9.18,11版)[20],使用60 L/min的连续吸入流量,通过在双级冲击器中雾化溶液收集样品进行这些测试。简单地说,在上下撞击腔中分别加入7或30 mL的25 mM磷酸盐缓冲液。喷雾器一直运行到溅射(用于喷射喷雾器)或设备自动停止(用于网状喷雾器)。收集上撞击室的每个样本,取至终体积为10 mL,收集下撞击室的每个样本,取至终体积为50 mL,加入磷酸钾缓冲液。溶液立即通过动态光散射、尺寸排除色谱和圆二色性进行测试。

动态光散射,DLS

收集起始蛋白溶液和安瓿中残留的蛋白溶液并进行定量。为了进行DLS分析,通过比较样品本身或在10 mM NaCl水溶液中稀释后获得的信号来优化蛋白质浓度。当原始样品和稀释后的样品之间没有观察到差异时,考虑对样品进行测量(例如,对于来自撞击室的样品),因为溶液中的分子之间应该没有相互作用;否则,考虑稀释后的样品,如来自安瓿的样品,在10 mM NaCl水溶液中稀释1:10。测量使用Zetasizer Nano (Malvern Instruments, UK),配备633 nm激光器,采用NIBS检测(173°背散射),温度为25°C。样品在获得后立即进行分析,没有任何延长的储存或冷冻步骤,以避免时间和温度相关的聚集。对每个样本进行三次测量,如果相关函数的截距在0.8和1之间,则认为有效。取3个重复的平均值,计算平均大小和多分散指数。

粒径排除色谱法

色谱分离采用卓越高效液相色谱系统,结合UV检测器和LabSolutions软件(Shimadzu, Kyoto, Japan),采用BioSep-SEC-2000色谱柱(300 mm, 1.50 mm, 5 μM Phenomenex, Torrance, CA, USA),等密度洗脱模式,流动相为50 mm K2HPO4, 300 mm NaCl pH 7,泵送流速为1 mL/min。注射量为50 μL,估计蛋白浓度为1 mg/mL。采用SPD-20A型紫外检测器(Shimadzu Kyoto, Japan),波长220 nm。样品在16000 × g离心30min后加载。每次色谱运行持续15分钟。通过使用色谱柱性能检查标准,水溶液型SEC 1 (Phenomenex)建立的校准曲线估计聚集体的大小,包括肌红蛋白(17 kDa),卵白蛋白(44 kDa), IgG (150 kDa), IgA (300 kDa)和牛甲状腺球蛋白(670 kDa)。

圆二色性,CD

CD光谱采集使用Jasco J-1500偏振光谱仪(Jasco, Tokyo, Japan),配备Peltier恒温装置,温度为20°C,使用0.1 mm光学长度的石英电池,由Jasco spectra Manager II软件驱动。在pH为7的10 mM K2HPO4缓冲液中,蛋白浓度为5µM。在250 ~ 180 nm范围内,数据间距0.5 nm, DIT 8 s,带宽2 nm,扫描速度为50 nm/min。每个光谱是3次平均累积的结果。利用Dichroweb服务器[24]进行二次结构估计。所有CD光谱都在缓冲背景下进行了校正。在220 nm处,远紫外CD信号随温度从20°C升高到90°C而变化,步骤为5°C,每个温度下的平衡时间为1 s,然后记录测量结果。利用CalFitter算法[25]对热跃迁进行了分析。

统计分析

使用Microsoft Excel for Mac对数据进行t检验分析。p < 0.05为差异有统计学意义。如果没有特别说明,测量一式三次,用平均值和标准差表示。


目录


摘要
介绍
材料与方法
结果与讨论
结论
数据可用性
参考文献
致谢

作者信息
道德声明




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结果与讨论

剂量和潜在给药方案的初步评估

在这项工作中,我们调查了使用雾化AAT作为一种替代,或至少作为一种支持,肠外输注。吸入药物是组合产品,其性能,就剂量和到达目标深肺的剂量的比例而言,受到配方和装置的适当组合的强烈影响。对于合适的剂量,初步需要对AAT的潜在剂量进行评估。据报道,上皮衬里液(ELF)中AAT的保护阈值为1.3-1.7 μM[26],而健康受试者的水平约为3 μM (0.15 mg/mL -低阈值0.07 mg/mL)。由于ELF的体积估计在10 - 30ml之间,因此应到达深肺的活性蛋白的质量在1.5 - 4.5 mg之间(下限为0.7-2.1 mg)。考虑到雾化过程中可能会损失蛋白质,并且雾化结束时仍有一部分溶液(约1ml)留在安瓿中,我们设定的目标剂量为150mg。这一剂量几乎是其他临床试验(NCT01217671和NCT04204252[18,28])给药剂量的两倍,但这不应构成安全问题,因为此前对无过敏反应迹象[14]的患者给予高达500 mg/天的重组AAT (rAAT), 100 mg hAAT每天两次,持续1周,也没有不良反应b[29]。我们选择的AAT浓度为25mg /mL,这与Prolastin®在水中重组后的浓度相对应,根据制造商的说明。这种选择将允许在标签外使用商业产品,而不改变冻干产品中存在的盐和辅料的最终浓度。事实上,高渗可引起支气管收缩[31]和咳嗽[32]等不良反应[30],从而降低肺内沉积的有效性。在给定浓度为25mg /mL的情况下,通过单次雾化6ml可以达到150mg的建议剂量,这也对应于两个雾化器安瓿的最大容量。

e雾化器雾化性能的评价

我们测量了两种雾化器在雾化4分钟后对25mg /mL AAT溶液中液滴大小分布的影响(表1)。尽管喷射雾化器的GSD更高,但MMAD值具有可比性。特别是,喷射雾化器的MMAD (3.9 μm)符合生产商的规格,与Griese等人报告的AAT值(3.5 μm)[15]和Hatley等人报告的AAT值(3.67±0.72 μm)[33]一致,与Brand等人报告的AAT值(4.4±2 μm)[16]无统计学差异。与后者的明显差异可以归因于不同类型的冲击器(8级级冲击器,而不是被认为更有效的NGI)或该研究中使用的不同AAT浓度(50 mg/mL AAT vs. 25 mg/mL),尽管由于更高的蛋白质浓度而增加的粘度预计会减小液滴大小[34,35]。重组后的促生素®中盐的存在也应考虑在内,这可能是MMAD[34]减少的部分原因。这种效应也可以解释用网状雾化器雾化时的MMAD (3.3 μm)低于生产商规范中报告的MMAD (4.1 μm),以及Hatley (4.4 μm)报告的值(通过激光衍射在沙丁胺醇溶液[33]上测量),以及Brand等人(4±1.6 μm)使用类似的振动网状装置(AKITA2 APIXNEB)在放射性标记的Prolastin®溶液中测量35 mg/mL[17]。最后,两种雾化器的细颗粒含量均显著高于Hatley等人(喷射雾化器为67.5±1.0%,网状雾化器为59.9±3.7%)[33]和Brand等人(AKITA2 APIXNEB为67-70%)[17]。

表1两个雾化器得到的空气动力直径质量中值、几何标准差和细颗粒分数4 min后进行NGI评估(平均值±标准差;n= 3)

网状雾化器产生的细颗粒分数显著高于喷射雾化器(t检验,p < 0.001)。

这种差异是由于网状雾化器在NGI的第3-6阶段积聚的大多数液滴以15 L/min的速度在5.39和1.36 μm之间聚集(图1),这可以归因于网状膜的积极作用,网状膜有助于产生更小的液滴。这一结果与Brand等人使用AKITA2 APIXNEB[17]报告的数据非常一致。同样的两个雾化器在雾化160 mg粘菌酸钠时也观察到类似的差异(71.9%网状比59.7%喷射)。

图1
figure 1

用喷射喷雾器和网状喷雾器雾化AAT溶液后得到的AAT质量分布。柱状图表示标准差(n = 3)

通过延长雾化时间,两种雾化器的发射分数和细颗粒分数与雾化时间呈线性关系(图2)。两种雾化器的回归线斜率相似。因此,没有观察到雾化效率的降低,这与Steckel和Eskandar对类似于这些试验中使用的喷射雾化系统的报道不同:在该工作中,效率的降低归因于溶剂蒸发引起的安瓿中溶液浓度的增加。本研究通过在预冷的50毫升试管中取样未稀释的雾化产品来研究这方面:在定量之前,将样品离心以去除任何因蛋白质变性而产生的不溶性聚集体。从两个雾化器收集的样品中,没有检测到可见的聚集体,也没有检测到蛋白质溶液原始浓度的变化,通过紫外线吸收度评估。

图2
figure 2

喷射喷雾器(空方形)和网状喷雾器(实心三角形)在NGI中雾化溶液后AAT的释放分数(左)和可吸入分数(右)。柱状图表示标准差(n = 3)。这些线是实验数据线性回归的图形表示。发射分数射流雾化器y = 3.1429x + 0.381 (R2 = 0.9727)虚线;网格雾化器y = 3.0351x + 2.5272 (R2 = 0.9662)虚线;可吸入馏分喷射雾化器y = 2.6202x + 0.7664 (R2 = 0.9678)虚线;网格雾化器y = 2.9912x + 2.372 (R2 = 0.9634)虚线

对于两种类型的雾化器,雾化时间不影响液滴大小分布,因为在MMAD中没有发生移位。然而,使用网状雾化器时,分布的宽度较小,GSD值较低(表2)。

表2两个雾化器雾化后2、4、6 min及雾化结束时NGI得到的质量气动直径中位数和几何标准差(均值±标准差;n= 3)

DDR和DD的测定

为了评估DDR和DD,在安瓿中填充6ml AAT溶液,通过将雾化器连接到正弦泵进行雾化(表3)。特别注意从收集过滤器中回收蛋白质,以避免发生变性情况。正如之前报道的那样,这是关键的一步。因此,过滤器不经过超声波提取蛋白质,使用冷磷酸盐缓冲液作为稀释剂,所有样品在尽可能短的时间内离心处理。在此条件下,质量回收率为98±7%。

表3两种雾化器对AAT溶液的输送值(均数±标准差;n= 3)

将NGI获得的可吸入分数值与DD值相结合,估计喷射雾化器的细颗粒剂量为25.1 mg,网状雾化器的细颗粒剂量为39.9 mg。两种雾化器的DDR,根据药检规范评估,具有可比性,但使用网状雾化器时,总给药量显著高于使用网状雾化器(t检验p = 0.033)。因此,后者在输送溶液方面比喷射雾化器效率更高,同时考虑到完成雾化的时间更短,并且由于网状装置的自动停止,在安瓿中留下了约1ml的负载溶液。

e雾化后AAT活性的评估

在处理吸入产品时,通常定义三种剂量:标签上的剂量(计量)、设备释放的剂量和到达深肺的剂量。如果活性成分是蛋白质,还必须考虑第四剂量值,即以仍然具有生物活性的形式到达深肺的剂量。因此,我们测量了可溶性AAT的特定弹性酶抑制活性(即,活性除以从DD/DDR实验中获得的每个部分中测量的蛋白质量),以评估雾化后氧化或变性可能导致的失活。相对AAT活性以复悬后立即测量的百分比表示。如图3所示,随着雾化时间的增加,蛋白质的活性趋于降低,两种雾化器的趋势相似。在同一时间点,两种雾化器之间没有显着差异。雾化1 min后,两种雾化器的活性与初始溶液的活性无显著差异(t检验),喷射雾化器的活性为84%(±4%),网状雾化器的活性为87%(±11%)。活性的轻微降低可以至少部分归因于从过滤器中回收的过程,这不能从雾化的效果中区分出来。

图3
figure 3

用喷射喷雾器和网状喷雾器雾化溶液后获得的AAT活性与起始蛋白活性的比较(虚线)。#相对于初始解;§相对于F1;**p < 0.01, **p < 0.001

无论如何,经过相同的恢复程序,在喷射喷雾器雾化结束时,活性下降到72%(±15%),与起始溶液没有显著差异,而使用网状喷雾器时,最终活性比起始溶液低60%(±11%),这表明雾化程序是活性丧失的主要原因。对于这两种喷雾器,相对于起始溶液和最终雾化产品,安瓿中残留溶液中的AAT活性明显较低:这可能归因于安瓿中的溶液被反复强调的事实。随着时间的推移,活性的降低可能与变性或蛋氨酸氧化有关。

据我们所知,这是第一篇报告喷射和网状雾化时AAT活动数据的论文。这两种雾化器对蛋白质完整性的影响与一篇关于胰岛素样生长因子I雾化的论文一致,该论文与使用喷射式雾化器或网状雾化器[38]表现出相当的性能。在这两种情况下,观察到蛋白质活性的降低相对于起始溶液。在这个意义上,网状雾化器似乎没有提供一个更好的保存相对于射流雾化器。与后者相关的数据与先前报道的eFlow®雾化后AAT残留活性(95±11.3%)不同[39,40]。值得强调的是,在DD/DDR试验中,蛋白质溶液的暴露条件应被视为最坏情况,考虑到持续的空气暴露和在固体干燥支架上的收集。

e雾化后AAT聚集的评估

为了确定特定活性随时间部分丧失的原因,我们通过DLS评估了雾化前后AAT的潜在蛋白质聚集。直接研究气溶胶中的蛋白质稳定性是理想的,但不可行。在欧洲药典提出的雾化产品气动性能评估仪器中,我们选择了双级冲击器。这一选择主要有两个原因:第一是直接在液体中收集雾化产品,在我们看来,更能代表雾化液滴在肺部发现的潮湿环境;肺上皮液的体积估计在10 - 30ml之间,接近Eur规定的体积。来填充撞击腔。第二个原因是,使用撞击器而不是撞击器可以减少由于长时间暴露在空气中的蛋白质状态的干扰,特别是对于NGI,与金属成分接触的干扰,或者在DD/DDR测试中,从过滤器中回收的干扰。撞击室中收集的样品的DLS分析表明,溶解后,AAT溶液呈现单一的大分子群,其水动力直径为7 nm,与先前关于单体、单分散AAT的报道大致一致[23,41]。图4中的图形显示了尺寸高达100纳米,以突出显示样品中的任何差异。用两种喷雾器雾化并没有改变蛋白质的聚集状态,因为没有其他种群出现在安瓿中,也没有出现在双阶段撞击器收集的分数中。

图4
figure 4

双级撞击实验中射流(A)或网状(B)雾化器雾化前后溶解于水中的AAT的体积分布分析

SEC分析-在我们的配置中,在17-670 kDa MW范围内(高达15米的AAT)敏感-表明洗脱时间约为8.5分钟的主要波段与单体糖基化AAT(约54 kDa)一致(图5)。洗脱时间为5- 7分钟的多个低强度波段与分子量范围为150 - 670 kDa的聚集体一致。网状喷雾器和喷射喷雾器雾化和未雾化AAT的色谱图基本重合,证实雾化不影响聚集。此外,在我们的测试中,我们没有发现任何证据表明由喷射或网状雾化器雾化引起的溶液浓度增加,这与Steckel对喷射雾化器[37]的报道不同。总的来说,聚集似乎不是AAT活性丧失的原因,随着时间的推移,蛋氨酸氧化是最有可能导致AAT失活的原因。

图5
figure 5

用喷射喷雾器雾化后样品的SEC分析与起始溶液的比较。用网状喷雾器雾化所得样品与初始溶液进行对比分析。面板A的插入显示了用于估计分子量的校准曲线。洗脱时间在8.5 min左右的条带对应一个54 kDa的蛋白,与糖基化的AAT一致

e雾化后AAT变性的评价

由于已知温度会影响蛋白质的稳定性,因此在雾化前后对安瓿中的温度进行了监测。网状雾化器的温度显著升高(+ 10.0°C±3.1°C),而喷射雾化器的安瓿温度无显著升高(+ 0.4°C±2.3°C)。为了评估这些温度变化是否可能导致蛋白质变性,从而导致其比活性的部分损失,我们测量了雾化前后蛋白质的CD光谱。如图6A所示,光谱是完全重叠的。

图6
figure 6

用喷射喷雾器和网状喷雾器雾化后样品的CD分析与起始溶液的比较。B AAT的圆二色光谱(实线),90℃孵育后的AAT(虚线)和90℃孵育后缓慢返回到20℃的AAT(虚线)。插图:温度斜坡,计算Tm为69°C

二级结构分析使用Dichroweb服务器确认几乎相同的结构(表4)。

表4 seco的分数二级结构公司内容为e用dichroweb服务器计算。每个值是两个独立制剂分析的平均值

为了确认雾化过程中AAT暴露的温度不影响其折叠,我们在220 nm下进行了CD监测的热变性实验。转换温度(Tm)为69°C(图6B,插入)。然而,与该Tm相关的转变并不与二级结构的完全损失相关,正如CD光谱所显示的那样,在90°C以下,二级结构部分保留(图6B)。此外,加热至90℃后缓慢冷却得到的CD谱与AAT起始溶液的CD谱几乎相同,表明二级结构变化是可逆的(图6B)。

排除了安瓿中AAT的沉淀、聚集和热变性,表明AAT比活性下降高达50%可能与AAT氧化有关,特别是在Met358和Met351[42]残留物处。使用喷射喷雾器雾化时,由于蛋白质溶液的再循环,导致蛋白质反复暴露在气液界面上,预计蛋白质的氧化会更大程度地发生。由于这个原因,安瓿中的残留物被认为是喷射雾化[43]的最坏情况,并且预计活动会持续减少。另一方面,原则上,网状雾化器安瓿中残留溶液的稳定性不应该是一个主要问题,因为它不会再循环[7]。与预期不同的是,网状雾化器安瓿瓶中的残余AAT活性较低,与喷射雾化器安瓿瓶中的AAT活性相当,再次暗示氧化是雾化过程中的主要降解机制。

总的来说,使用喷射喷雾器而不是网状喷雾器没有任何优势。两种雾化器完成雾化所需的时间没有显著差异,喷射雾化器为17±3分钟,由听到典型的溅射声确定,网状雾化器为15±3分钟,由设备自动停止确定。但是,考虑到网状雾化器在相同的雾化时间内所输送的剂量更高,从效率上来说,后者总体上更可取。



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