2023-10-18 22:30

ipsc衍生的三维脑类器官模型和嗜神经病毒感染

摘要

二十多年来,干细胞研究的进展使医学领域发生了革命性的变化。最近,诱导多能干细胞(iPSCs)的发现使得先进疾病建模和组织工程平台的发展成为可能。多能干细胞是通过表达建立多能性所需的转录因子,将成年体细胞重编程为胚胎样状态而产生的。在中枢神经系统(CNS)的背景下,iPSCs具有分化为多种脑细胞类型的潜力,包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和少突胶质细胞。在体外三维(3D)培养中,iPSCs可用于生成脑类器官。脑类器官3D建模的最新进展为更好地理解疾病进展中的细胞间相互作用,特别是嗜神经病毒感染提供了途径。由于缺乏中枢神经系统细胞网络的多细胞组成,嗜神经病毒感染很难在体外二维培养系统中进行研究。近年来,3D脑类器官已成为建模嗜神经病毒性疾病的首选,并为更好地理解病毒感染和细胞反应的分子调控提供了宝贵的信息。在这里,我们全面回顾了ipsc衍生的3D脑类器官培养的最新进展及其在主要嗜神经病毒感染建模中的应用,包括HIV-1、HSV-1、JCV、ZIKV、CMV和SARS-CoV2。

Three-dimensional (3D)脑类器官培养

人脑是我们身体中最复杂的器官,由于对活体人脑组织的获取有限,其发育和人类特异性病理的许多方面仍然未知。因此,为了在体外系统中重现人类大脑,已经产生了许多方法和模型。

二维(2D)细胞培养系统历来被用于体外模拟各种疾病和系统;然而,当涉及到像人类大脑这样的复杂系统的建模时,它们是相当有限的。2d细胞培养系统缺乏存在于大脑中的细胞组织,因为它们以单层形式生长,这将细胞相互作用限制在其周围。这导致缺乏适当的氧气和营养扩散以及废物清除(Antoni et al. 2015)。此外,二维系统缺乏大脑中存在的组织复杂性。由于细胞通常作为单一细胞类型培养,它们缺少存在于体内的不同细胞类型之间的细胞间相互作用。为了创建一个更类似于人类大脑中细胞相互作用的2D系统,可以创建细胞共培养,例如将神经元与其他神经细胞类型(如小胶质细胞)共培养(Haenseler et al. 2017;Vahsen et al. 2022)。尽管有这些共培养技术,这些细胞仍然局限于外周接触,缺乏体外重现人脑所需的组织。

各种神经细胞,如原代神经元和神经母细胞瘤细胞,已被用于神经科学研究的2D系统中(Liu et al. 2022)。然而,获得患者来源的脑组织,或可分化为神经细胞的神经干细胞和胚胎干细胞是有争议的,而且并不总是可以获得(Gabriel和Gopalakrishnan 2017)。诱导多能干细胞(iPSC)技术的创新缓解了这一问题,它为无需直接从人类中枢神经系统(CNS)分离细胞就能产生人类神经细胞类型打开了大门(Gabriel and Gopalakrishnan 2017)。体细胞衍生的多能干细胞是一种可以在体内分化成其他细胞类型的干细胞(Lyadova and Vasiliev 2022),这使它们成为研究人员的可用来源(Karagiannis and Kim 2021)。多能干细胞是由Takahashi和Yamanaka 2006年在日本京都大学开发的,他们首先在小鼠胚胎干细胞(ESCs)中诱导多能性,然后在一年后在成人成纤维细胞中诱导多能性(Takahashi和Yamanaka 2006;Takahashi et al. 2007)。Takahashi和Yamanaka利用逆转录病毒载体将特异性转录因子如Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc引入皮肤细胞,从成纤维细胞培养中生成iPSCs。他们注意到,他们的iPSCs既显示ESCs的形态和生长特性,又表达ESCs特异性标记基因(Takahashi和Yamanaka 2006;Takahashi et al. 2007)。研究人员已经创造了不使用病毒载体(如基于质粒或片段重编程)生成iPSCs的技术,这可以消除由于病毒整合到基因组中而导致的突变风险(Bang et al. 2018)。这种方法涉及电穿孔,其中电击将质粒引入细胞的基因组。此外,基于crispr的重编程允许对某些基因进行精确和有效的编辑,以实现成功的重编程(Liu et al. 2018)。

人类多能干细胞(hiPSC)被证明是在培养中容易产生人类神经细胞类型的强大工具;然而,分化的细胞仍然是二维的,并且与前面列出的其他二维细胞培养系统一样受到限制。这导致需要开发替代模型来研究体外系统,同时模拟体内环境,如3D培养系统。最早成功的3D神经系统之一是神经球。神经球是培养的多能神经干细胞(NSC)的三维细胞聚集体,为体外研究NSC提供了良好的资源(Soares et al. 2021)。然后,这些NSCs集群可以分化成不同的细胞类型,如神经元和神经胶质细胞,它们都在同一个球体内,也称为神经球体(Dingle et al. 2015;Zhou et al. 2016;Pamies et al. 2017)。这进一步允许在体外更好地表示细胞间的相互作用。尽管这些系统在体外比传统的二维细胞培养能更好地代表大脑,但它们缺乏完整的细胞组成、组织和人类大脑的复杂性(Reynolds et al. 1992;Pamies et al. 2017)。人类大脑具有非常特定的区域特异性和细胞组织,这对其功能至关重要,而这在神经球和神经球中是缺乏的,因为细胞没有组织(Dingle et al. 2015)。

与2D细胞培养系统和神经球不同,脑类器官能够在细胞、结构和发育水平上模拟人脑,使研究人员能够以以前不可能的方式模拟人脑及其功能。脑类器官最早是由Lancaster et al.(2013)作为研究小头畸形的系统生成的。他们成功地生成了ipsc衍生的3D细胞系统,他们称之为“脑类器官”(COs),该系统显示了离散的大脑区域、背皮质组织、功能性皮质神经元和神经胶质细胞群(Lancaster et al. 2013)。该系统的开发是神经科学研究的重大突破,因为它是第一次能够在体外以正确的组织和模式再现人类大脑。

为了生成类器官,为iPSCs或组织源性细胞(tdc)提供了特定的条件,如细胞外基质(ECM)、小分子和生长因子(Zhao et al. 2022)。因此,这种环境将使iPSCs或tdc分化为目标组织,如肺、心脏和大脑皮层(Zhao et al. 2022)。由于干细胞的可用性,研究人员使用iPSCs等干细胞来生成脑类器官(Gabriel and Gopalakrishnan 2017)。该方法涉及利用小分子和生长因子将单细胞iPSCs分化为胚状体(EBs),然后分化为NSCs (Hong et al. 2022)。在EBs诱导期形成神经上皮细胞(Hong et al. 2022)。扩张阶段包括将EBs嵌入ECM(如Matrigel),这导致萌芽形态,并促进进一步分化为COs中存在的几种细胞类型,如NSCs、神经元和胶质细胞(Agboola et al. 2021)。在成熟阶段和之后,扩大的EBs在轨道振动器(Lancaster and Knoblich 2014)或旋转生物反应器(Qian et al. 2016)中悬浮培养,成为自组织的co。

使用这些协议生成的类器官被称为“非引导类器官”,因为它们可以自由地组织到前脑、中脑和后脑区域(Lancaster et al. 2013;Qian et al. 2016)。这允许在体外重现整个大脑,这是一个非常有用的工具;然而,有些疾病会影响大脑的特定区域。因此,有必要能够专门模拟前脑、中脑或后脑,以及大脑中的特定结构作为类器官。

许多研究小组都在努力开发指导方案,利用外部因素来产生大脑区域特异性的类器官,这些类器官包含更精确的细胞群和特定大脑区域和结构的组织。一种常用的引导类器官是皮质类器官,它代表大脑皮层。皮质类器官已被用于研究多种神经疾病,如寨卡病毒(ZIKV)感染(Qian et al. 2016)、日本脑炎病毒(Zhang et al. 2018)、阿尔茨海默病(AD) (Raja et al. 2016)和其他几种神经退行性疾病。除了皮质类器官,许多其他的大脑区域和结构已经成功地使用引导协议生成。这些包括前脑和中脑类器官(Raja et al. 2016;Jo et al. 2016),丘脑和下丘脑类器官(Xiang et al. 2020;Huang et al. 2021)、垂体类器官(Matsumoto et al. 2020)、小脑类器官(Ballabio et al. 2020)和后脑/脑干类器官(Eura et al. 2020)(图1)。

图1
figure 1

使用引导或非引导成熟方案,以及组装体形成,从干细胞衍生的胚胎体中分化不同类型的人类大脑类器官(由biorender.com创建)。脑类器官用H&E染色,神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞分别用免疫组化(IHC) TUJ-1/MAP2、IBA1、GFAP和Olig2特异性抗体可见

这些特定区域的类器官可以单独研究,但它们也可以组合成所谓的“组装体”,形成更复杂的类脑结构(图1)。Bagley等人融合了背侧和腹侧前脑类器官,产生了背-腹侧轴,并能够证明这些融合的类器官可以模拟大脑不同区域之间复杂的相互作用(Bagley等人,2017)。在另一项研究中,Xiang等人将丘脑类器官与皮质类器官融合,研究了丘脑和皮层之间的回路组织和相关疾病(Xiang et al. 2019)。此外,Miura等人生成皮质纹状体组合体来模拟复杂的远距离前脑回路(Miura等人,2022)。

尽管大脑类器官被证明是体外模拟大脑的一种更好的方法,但它们并非没有局限性。最值得注意的是,类器官的营养物质和氧气向其中心的扩散有限,因此,通常尺寸有限,并且易于在其核心内发生细胞死亡(Lancaster et al. 2013)。有限的扩散可能是由于类器官内缺乏循环系统。为了克服这一挑战,研究人员试图通过几种不同的方法来创造血管化的类器官。Pham等人成功使用的一种方法是将来自同一系iPSCs的内皮细胞嵌入脑类器官(Pham et al. 2018)。另一种方法是在脑类器官和脑血管类器官之间创建组装体,这种方法能够概括血脑屏障的几个方面(Sun et al. 2022)。此外,类器官的血管化已经在体内移植模型中完成。Mansour等人将人类ipsc衍生的脑类器官移植到成年小鼠大脑中,并能够看到广泛的血管化,类器官与宿主大脑之间的神经元整合以及小胶质细胞浸润(Mansour et al. 2018)。类器官的血管化仍在进行中;然而,有许多有希望的方法来改善这个系统和改善人类大脑的体外模型类器官。

大脑类器官通常是通过抑制中胚层和内胚层的形成,将多能干细胞推向神经外胚层谱系而产生的。因此,据报道,许多使用的类器官缺乏小胶质细胞,小胶质细胞来自中胚层,对研究大脑中的免疫反应至关重要。Dos Reis等人的一项研究通过将人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的小胶质细胞整合到两周大的类器官中,将小胶质细胞整合到类器官中(Dos Reis et al. 2020, 2023)。然而,Ormel等人表明,小胶质细胞可以在CO内先天发育(Ormel等人,2018)。这为研究小胶质细胞、神经元和其他胶质细胞之间的相互作用以及模拟免疫反应对大脑的影响(如病毒感染)提供了宝贵的资源。

由于缺乏体外多细胞组成物以及人与小鼠大脑在体内的差异,嗜神经病毒感染在体外和体内都难以准确研究。重要的是,病毒既可以直接感染细胞造成影响,也可以通过感染细胞释放细胞因子、趋化因子、病毒蛋白和其他毒性因子间接影响未感染的细胞。这在观察艾滋病毒等病毒时尤其重要,这些病毒会感染小胶质细胞,并对不易感染艾滋病毒的神经元具有神经毒性作用(Kovalevich和Langford 2012)。此外,体内小鼠系统不能准确地代表人类大脑,某些病毒如JC病毒(JCV)和HIV-1不能感染小鼠,这就需要一个更好的基于人类的系统。因此,3D脑类器官可能为体外模拟人类嗜神经病毒感染提供一个令人难以置信的强大系统。

三维脑类器官中的神经hiv建模

HIV是一种逆转录病毒,通过病毒蛋白与宿主细胞受体CD4和cc趋化因子受体5 (CCR5)或cxc趋化因子受体4 (CXCR4)的相互作用进入靶细胞(Deeks et al. 2015)。在初次感染后不久,HIV进入中枢神经系统并建立病毒库,导致神经发病(丁等人,2001;Zayyad and Spudich 2015)。在大脑中,小胶质细胞是HIV感染的主要细胞类型,而星形胶质细胞的感染仍然存在争议,尽管它们可能在神经发病机制中起关键作用(black - werner 1999;Wallet等人,2019)。神经元通常不会被HIV感染,但可能受到间接机制的损伤,例如毒性病毒蛋白和神经胶质激活产生的神经毒性(Kovalevich和Langford 2012)。在艾滋病毒/艾滋病大流行的早期,预联合抗逆转录病毒疗法(cART)时代,估计有20-30%的艾滋病毒患者出现艾滋病毒相关痴呆(González-Scarano和Martín-García, 2005年)。随着cART的出现,HAD的发病率显著下降,尽管很大比例的HIV感染者(PWH)仍然出现神经系统疾病,被归为HIV相关神经认知障碍(HAND) (Antinori et al. 2007;Clifford and Ances 2013)。HAND的表现范围从无症状神经认知障碍(ANI)到轻度神经认知障碍(MND)和hiv相关痴呆(HAD) (Clifford and Ances 2013)。

了解HIV的神经病理学对于阐明PWH中认知障碍的相关机制尤为重要。研究HIV神经发病机制的主要障碍之一是缺乏准确概括HAND的体外培养模型,因为多种中枢神经系统细胞类型可能参与病理。此外,过去也曾使用动物模型,如非人灵长类动物(NHP)或转基因小鼠模型。尽管这些动物模型帮助研究人员了解了HIV病理生理学的许多方面,但在理解HIV- cns相互作用导致神经认知障碍方面仍存在一些局限性(Mallard and Williams 2018)。在人类中,对HIV神经病理学的研究仅限于收集和分析死后的脑组织。大多数体外神经hiv的研究都是在2D培养模型中进行的,使用永活的小胶质细胞系、外周血单核细胞来源的小胶质细胞(MMG)或从人体组织中分离的原代人小胶质细胞(Garcia-Mesa et al. 2017;Rawat and Spector 2017;Rai et al. 2020)。最近在iPSC培养研究和脑类器官的产生方面取得的进展已经允许创建2D和3D体外模型来研究人类的神经hiv。

最近,两组研究人员描述了人类大脑类器官中的艾滋病毒模型(dos Reis et al. 2020;Gumbs et al. 2022),有可能被神经hiv研究界采用并进一步发展。这两组使用了两种不同的方法来培养含有小胶质细胞的人脑类器官,小胶质细胞和巨噬细胞是大脑中负责HIV感染和复制的主要细胞类型(Wiley et al. 1999)。Dos Reis及其同事开发了一个3D人脑类器官(hBORG)模型,其中含有小胶质细胞(MG),这些小胶质细胞在整合到hBORG中之前感染了HIV。利用星形胶质细胞分化培养基和神经细胞培养基的组合,首次从神经元祖细胞(npc)中生成神经球。生成的hBORGs仅包含神经元和星形胶质细胞。HMC3细胞是一种永活的人小胶质细胞系,首先被嗜神经性HIV-1 (NL(YU2-Env)-EGFP)报告病毒感染,然后置于hBORGs之上。作者表明,大多数小胶质细胞位于hBORGs的外层,其中一些迁移并嵌入类器官。此外,将来自死后成人脑组织的hiv感染或对照(未感染)的初级人类小胶质细胞与hBORGs结合。有趣的是,hiv感染的人小胶质细胞显示出一定程度的浸润到hBORGs中,并建立了生产性感染。此外,与模拟感染的MG-hBORGs相比,感染HIV的HMC3和含有hBORGs的原代小胶质细胞培养上清中TNF-α和IL-1β水平均较高。这表明在MG-hBORG模型中(在某种程度上)从hiv感染者的死后脑组织中再现了HIV-1中枢神经系统病理标志。在评估感染原代MG-hBORGs的细胞毒性时,还观察到神经元细胞死亡的增加。此外,观察到β iii -微管蛋白(神经元)mRNA的减少和GFAP(星形胶质细胞)表达的增加,提示神经元丢失和星形细胞增多,这是严重HAND相关神经病理的两个特征(熊焕桂2013)。虽然这些MG-hBORG模型在HIV感染的建模方面取得了进展,并概括了HIV CNS疾病的某些方面,但它们也有一些局限性。首先,外源性添加的小胶质细胞与类器官的有限结合并不能真正代表体内条件。小胶质细胞的内源性和自然分布与其他细胞类型(包括神经元和星形胶质细胞)在类器官内适当发展的相互作用将更好地代表神经hiv的病理生理。最近,Gumbs及其同事(Gumbs et al. 2022)利用先前由同一组建立的含有小胶质细胞的3D脑类器官模型(Ormel et al. 2018)实现了这一目标。在诱导和扩增的早期阶段,利用三种胚层的细胞生成多能干细胞。特别是,具有产生小胶质细胞潜能的中胚层祖细胞的形成,对于具有小胶质细胞结合的COs的发展是一个巨大的进步。事实上,细胞特异性标记物的分析显示,COs中含有神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞,以及小胶质细胞中CD4和CCR5受体的表达。为了评估这些细胞的HIV-1感染性,作者分离出类器官来源的小胶质细胞(oMG),并将其与人初级小胶质细胞(pMG)一起感染CCR5 M-tropic hiv1_ball -luciferase和HIV-GFP报告病毒。正如预期的那样,oMG和pMG细胞都支持HIV-1感染。一旦病毒感染在co来源的小胶质细胞中被证实,HIV-1感染在COs中被表征。有趣的是,一个有趣的观察结果是COs中HIV感染的Matrigel干扰,这表明COs中HIV的建模可能需要进一步改进,以获得可靠和可重复的感染结果。此外,来自不同iPSC系的COs对HIV感染的易感性也存在差异。HIV受体的表达,如CD4、CXCR4和CCR5,在不同的类器官之间也存在差异。尽管如此,Gumbs等人描述的HIV感染CO模型提供了一个独特的平台(尽管需要进一步改进),以更好地了解体外3D培养系统中的细胞和病毒感染。

1型疱疹病毒人源性脑类器官模型

1型疱疹病毒(HSV-1)属于疱疹病毒科(阿尔法疱疹病毒亚科),由约152 kbp的双链DNA基因组组成,可编码约80种病毒蛋白(Denes et al. 2020)。青少年和成人中1型单纯疱疹病毒感染的全球流行率在45%至90%之间,原发感染通常发生在儿童期,并在感觉神经元中建立潜伏感染。1型单纯疱疹病毒的主要感染部位是嘴唇的皮肤和粘膜,很少发生在生殖器粘膜。感染后,病毒颗粒通过神经节神经元的轴突逆行移动到病毒DNA基因组组装成异染色质样结构的地方。由于神经元不分裂,不易受到免疫监视,1型单纯疱疹病毒感染神经元可导致终身持续感染。1型单纯疱疹病毒还能引起疱疹性角膜炎,导致角膜瘢痕和视力受损。最有害的单纯疱疹病毒相关疾病是疱疹性脑炎,这是一种罕见的疾病,当病毒到达中枢神经系统时,每年会影响100万人中的2-4人,死亡率很高(Bradshaw和Venkatesan 2016)。此外,孕妇面临生殖器疱疹母婴传播的风险,如果不进行紧急剖宫产,可能导致胎儿脑炎和围产期死亡(Kimberlin, 2004年;Messacar et al. 2018)。hsv -1相关神经系统疾病的病理生理特征尚不清楚,这促使研究人员建立相关的人类中枢神经系统体外模型,以了解病毒潜伏期、再激活和神经病理学的分子机制。

单纯疱疹病毒1型感染的主要研究对象是人类或非人类来源的原代或永生化细胞培养物和细胞系。然而,在许多情况下,由于不同实验中使用的细胞系的遗传资产的变化,所获得的结果具有可靠性和可重复性问题。此外,在细胞系上测试抗病毒候选药物往往不一致。因此,在大多数临床前研究中,已经在小鼠模型中评估了HSV-1疫苗的功效。这些体内模型提供了关于针对原发性单纯疱疹病毒1型感染的免疫反应的有用信息,但代价是疫苗对复发性病毒脱落和疾病事件的效力,这在小鼠中极为罕见(Gebhardt和Halford 2005)。缺乏将人类免疫反应转化为病毒感染的动物模型仍然是开发有效治疗性疫苗的主要限制(Dasgupta和BenMohamed, 2011年)。基于干细胞的技术的出现导致了人类体外模型系统的快速发展,这可能为临床前HSV-1研究提供所需的平台。

最近报道了第一项使用hipsc衍生的2D和3D神经元模型来研究1型单纯疱疹病毒感染基本特征的研究(D 'Aiuto et al. 2019)。本研究提供了令人信服的证据,证明HSV-1在hipsc衍生的CNS神经元中复制和潜伏期建立。潜伏期诱导方案采用α干扰素(IFN-a)和(E)-5-(2-溴化酰基)-2'-脱氧尿苷(5BVdU)联合抗病毒药物。在二维培养中,组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂诱导病毒再激活。在潜伏期诱导过程中,培养条件使病毒染色质进入异色状态,增加了潜伏期相关转录物(LAT)的表达,并增加了ICP4启动子区域中转录辅抑制因子KAP1的存在,这也显示了卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的潜伏期(King et al. 2015)。另一方面,在无支架脑类器官的3D培养中,HSV-1 LAT表达随着潜伏期的建立而增加,但在感染和抗病毒去除后的第8天至第11天,约17%的类器官观察到自发再激活,随后出现神经元形态改变,如神经元突变性和神经元合胞体形成。与同源的2D模型相比,HSV-1再激活在该3D模型中很少发生,可能是由于这两种模型之间观察到的细胞间和细胞与细胞外基质相互作用的差异。2020年,同一研究小组(Zheng et al. 2020)从假设神经元在npc的神经元分化过程中获得了HSV-1潜伏期位点的独有特征出发,利用hiPSCs作为2D单层或3D神经球培养,研究了npc感染HSV-1的情况。正如他们之前的研究(D 'Aiuto et al. 2019)所报道的那样,与2D NPC单层相比,3D神经球对HSV-1的易感性降低。此外,比较基因表达分析显示,与急性感染细胞相比,暴露于5BVdU/IFN-a的感染npc(在2D和3D培养中)的LAT表达和病毒基因表达显著降低。这些表达结果与体内中枢神经系统神经元中观察到的结果相似(Gussow et al. 2006),但在感觉神经节神经元中则不同。此外,该研究表明,NPCs中沉默的病毒基因组可能对磷酸肌苷3-激酶抑制剂(PI3Ki)没有反应。除了hipsc衍生的类器官外,微流控芯片与类器官结合代表了一种基于生物工程策略的独特方法,这种方法开始被广泛应用于模拟器官复杂性的平台。Mazzara及其同事(Mazzara et al. 2022)最近在微流控芯片上开发了一种体外人体3D细胞系统,利用hipsc衍生的背根神经节类器官(DRGO)和角质形成细胞单层,模拟不同人类感觉神经元与外周组织之间的连接,提供了一个强大的HSV-1潜伏期和再激活的体外模型。由于存在几种特定的HSV受体,DRGO可能被HSV-1有效感染,这被整个转录组谱证实。在添加了阿昔洛韦(ACV)的培养基中使用低滴度病毒的初次感染导致DRGO的潜伏期建立,并且通过分析LAT和晚期基因证实了感染的两个阶段(潜伏期和生产性感染)。此外,利用重组HSV-1病毒,将已报道的绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)基因分别克隆到潜伏病毒基因ICP0和糖蛋白C裂解病毒基因的启动子下,可以实时成像区分病毒潜伏期或再激活状态(Thompson et al. 2003)。在本实验中,在DRGO中检测到绿色荧光和LAT转录本,而人原代角质形成细胞(NHEK)仍未被感染,表明感染病毒颗粒无法从DRGO被动扩散到角质形成细胞。只有热应激导致DRGO中的病毒再激活,免疫荧光和基因表达分析均显示在两个芯片腔中都有产生性感染,因此本研究的研究人员得出结论,HSV-1仅通过轴突顺行途径从DRGO传播到NHEK。微流控芯片技术是研究嗜神经病毒感染分子机制的一个很有前途的工具,也是药物筛选、治疗反应和/或治疗验证的合适平台,否则其他体外模型无法充分研究。

在过去的十年中,一些发现表明1型单纯疱疹病毒感染与β -淀粉样蛋白(a β)相关的神经病变(如AD)有很强的相关性(Nilsson等,2010;李彪马等,2019)。一般来说,人类大脑中的β平衡是通过三个关键的检查站来维持的:(1)Aβ的产生,(2)Aβ通过血脑屏障(BBB)的运输,以及(3)Aβ的降解(Nilsson et al. 2010)。载脂蛋白E (APOE)是大脑中主要的胆固醇转运体,参与了Aβ在血脑屏障中的转运(Linard et al. 2020)和Aβ的降解(Baranello et al. 2015)。值得注意的是,APOE4的表达已被证明与HSV-1的频繁再激活和AD风险的增加相关(Linard et al. 2020)。Cairns等人(Cairns et al. 2020)开创了一种3D生物工程脑模型,通过将npc植入基于丝蛋白支架的微设备中,研究HSV-1感染对AD病理的影响。使用这种生物工程脑模型,发现HSV-1感染可以决定ad样表型的发生,包括Aβ形成、神经炎症、胶质瘤和神经网络功能减弱。然而,正如在COs中观察到的那样,该模型在人类大脑皮层的皮层细胞多样性和时空自组织方面存在局限性。最近,利用2D神经元培养和3D类器官,有报道称,hsv -1感染的COs可能是阿尔茨海默病病理生理的潜在模型,具有许多阿尔茨海默病特征的资本重组,包括β -淀粉样蛋白沉积、阿尔茨海默病介质失调、神经炎症和神经元分化受损(Qiao et al. 2022)。此外,AD介导基因PSEN1、PSEN2、achaete - scre同源基因(ASCL)和促红细胞生成素人肝细胞受体B (EPHB)在COs中显著上调,而BACE在HSV-1感染后表达降低。此外,在同一项研究中,Valacyclovir (VCV)和ribaavirin (RBV)已被报道能显著减少HSV-1的复制并挽救HSV-1诱导的COs病理表型。在早期的一项研究中,与未感染细胞或暴露于5BVdU和IFN-a的感染细胞相比,HSV-1感染的2D单层神经元培养物在icp4阳性细胞中呈现核周Aβ42,支持HSV-1触发Aβ42积累的能力(Abrahamson et al. 2021)。另一方面,当3D脑类器官感染HSV-1时,Aβ42免疫反应主要在icp4阴性神经元中观察到,而在icp4阳性神经元中很少观察到,这主要与感染失败细胞中强烈的抗病毒信号传导有关。这些观察结果表明,与2D培养相比,3D脑类器官可能为AD提供了更好的体外平台,其翻译结果更接近体内条件。

1型单纯疱疹病毒感染也被证明与妊娠、分娩和/或产后新生儿脑炎有关。宫内1型单纯疱疹病毒感染约占新生儿HSV感染的4-5% (Marquez et al. 2011),在许多情况下,它演变成致命的神经系统疾病(Straface et al. 2012;Pichler et al. 2015)。D 'Aiuto及其同事(D 'Aiuto et al. 2022)开发了一种简化方法来模拟HSV-1感染神经花环的神经发育结果,这代表了体外分化神经管的等效性(Broccoli et al. 2014)。利用由hipscs衍生的神经玫瑰花组成的早期脑类器官(ES-organoids)来研究HSV-1感染对神经发育的潜在神经病理影响。es -类器官感染HSV-1后,用ACV治疗较长时间(9-12周),这是产生具有皮质样结构的脑类器官所必需的。有趣的是,尽管进行了抗病毒治疗,但在hsv -1感染的es -类器官中观察到神经莲座的变化、结构完整性的丧失和神经元的改变。Qiao等(Qiao etal . 2020)也报道了利用COs建立的体外神经发育模型,结果显示HSV-1感染通过降低Nestin、后脑标记物(ISL1)的表达水平和降低皮质板层深度来失调神经发生,提示HSV-1诱导的大脑区域失调可能发生在胎儿大脑发育的不同阶段。

近年来,iPSCs为从相关疾病中生成个体特异性中枢神经系统细胞提供了一个极具吸引力的机会。然而,HSV-1与供体特异性细胞类型相互作用的可变性尚未得到深入研究。先前的研究仅限于对来自人成纤维细胞的hipsc衍生的中枢神经系统细胞中罕见的单基因先天性免疫错误的建模(Lafaille et al. 2012;Zimmer et al. 2018;Chansard et al. 2021)。最近的一项研究(Zheng et al. 2022)比较了低感染倍数下HSV-1感染对来自一名健康女性(02SF)和她的儿子(01SD)的两种hipsc衍生的NPC细胞系的增殖和迁移的影响。据报道,HSV-1影响02SF和01SD npc的增殖活性呈病毒剂量依赖性趋势,但HSV-1基因的转录活性存在差异。ACV处理能有效地抵消病毒对02SF中NPC增殖的抑制作用,而在01SD中则不能,其中NPC的迁移也比02SF中的NPC减少。作者得出结论,对ACV的敏感性和HSV-1对神经发生的影响受个体间差异的影响,这解释了为什么有些个体更有效地重新激活HSV,以及为什么中枢神经系统中的HSV-1感染可能对某些个体产生病理后果,而对其他个体则没有。Krenn及其同事(Krenn et al. 2021)也在脑类器官模型中研究了ZIKV和HSV-1对神经发育的影响,并表明这两种病毒感染人类npc并导致类器官大小减小,这与其他类器官研究一致(Qiao et al. 2020;D 'Aiuto et al. 2022)。这项工作还强调了对ZIKV和HSV-1的细胞先天反应的主要差异。

多瘤病毒JC感染人源性脑类器官模型

JCV感染少突胶质细胞导致进行性多灶性白质脑病(PML),这是一种致命的神经退行性疾病,主要影响免疫抑制个体,其特征是白质中脱髓鞘病变的多灶位点(Weissert 2011;Cortese et al. 2021)。虽然世界上90%以上的成年人感染了JCV (Weissert 2011),但PML仍然是一种罕见的合并症。JCV是一种非包膜双链DNA病毒,通过与细胞膜糖蛋白上唾液酸部分的初次接触进入宿主细胞,然后进行网格蛋白介导的内吞作用(Ferenczy et al. 2012)。病毒复制发生在细胞核中,而病毒颗粒的组装发生在细胞质中,并依赖于宿主细胞的DNA复制和蛋白质折叠途径(Ferenczy et al. 2012)。JCV主要感染少突胶质细胞(Barth et al. 2016),但也可能感染神经元,引起JC病毒脑病和JC病毒颗粒细胞神经病(Miskin and Koralnik 2015)。支持JCV复制的体外细胞包括人类胎儿神经胶质细胞(Padgett etal . 1971;Major et al. 1985;Mandl等人,1987),人胚胎干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞(Schaumburg等人,2008),人胚胎肾细胞(Miyamura等人,1980),神经胶质祖细胞,祖细胞衍生的星形胶质细胞和原代星形胶质细胞(Major and Vacante 1989;Messam et al. 2003;Ferenczy et al. 2013)。JCV是一种物种特异性病毒,只能感染人类。在小鼠或仓鼠中接种JCV导致肿瘤形成,没有溶解性感染和PML发展(Barth et al. 2016)。这种病毒特有的传染性已经干扰了PML体内动物模型的发展,延迟了对病毒发病机制和抗病毒药物模式的研究。2014年,通过将人胶质祖细胞植入免疫缺陷和髓磷脂缺陷小鼠体内,建立了人源化小鼠模型(Kondo et al. 2014)。然而,在该模型中,JCV感染导致病毒主要在人类星形胶质细胞中复制,由于人类少突胶质细胞掺入有限,因此脱髓鞘的迹象不能归因于病毒裂解感染。最近,Barreras及其同事(Barreras et al. 2022)建立了一个有前景的人脑类器官模型来研究JCV感染。脑类器官由神经元(70%)、星形胶质细胞(20%)和少突胶质细胞(10%)组成,直径300 ~ 350 μm。免疫组织化学和电子显微镜观察到JCV在三维类脑器官中具有病毒核包涵体的星形胶质细胞和少突胶质细胞的有效感染。人类来源的JCV脑类器官模型可以进一步促进我们对病毒发病机制的理解,并为筛选不同的治疗化合物提供高通量平台。

ZIKV、CMV和SARS-CoV-2在三维脑类器官中的建模

寨卡病毒是一种具有包膜和单链RNA基因组的黄病毒(Lindenbach and Rice 2003)。自2015年以来,寨卡病毒在巴西爆发,怀孕期间感染与新生儿小头症有关(Mlakar等人,2016年)。由于其对大脑发育的影响,许多研究者已经建立了体外脑类器官模型,并为寨卡病毒的病理生理提供了宝贵的知识。大多数调查类脑器官中寨卡病毒感染的研究使用非引导方案来生成类脑器官,只有少数使用引导方案。寨卡病毒感染已被证明会影响前脑类器官的生长和大小,以及心室带层的厚度(Qian et al. 2016;Xu et al. 2019)。此外,前脑类器官也被用作筛选小分子抑制剂抗寨卡病毒活性的平台(Xu et al. 2016;Li et al. 2020, 2022)。在几个脑类器官模型中的感染研究表明,ZIKV可以在npc、星形胶质细胞和神经元中复制,这些神经元定义了ZIKV神经病理学,主要是由于分化/成熟缺陷和诱导细胞死亡导致类器官的一般大小减小(Garcez等人,2016;Cugola et al. 2016;Dang et al. 2016;Wells et al. 2016;Gabriel et al. 2017;Zhou et al. 2017;Salick et al. 2017;Liu et al. 2019;Krenn et al. 2021)。综上所述,脑类器官具有优越的体外模型来研究ZIKV感染,使研究人员能够更好地了解病毒的病理生理,并将其作为筛选治疗干预措施的平台。

另一种与小头畸形相关的嗜神经病毒是人巨细胞病毒(CMV)。巨细胞病毒属于疱疹病毒科,是一种双链DNA病毒,可感染所有年龄段的人。虽然大多数巨细胞病毒感染是无症状的,但先天性巨细胞病毒感染的新生儿可能会出现神经系统异常,如嗜睡和小头畸形(Boppana等,2013)。几个小组已经报道了使用非引导方案在脑类器官中建立巨细胞病毒感染模型。脑类器官中的巨细胞病毒感染破坏了类器官的形态,可能是由于诱导细胞死亡导致体积缩小(Sun et al. 2020)。此外,巨细胞病毒感染会干扰npc的神经发生和神经花环形成(Sison et al. 2019)。此外,神经信号以及对神经发育重要的网络已被证明在脑类器官巨细胞病毒感染后下调(O 'Brien et al. 2022)。此外,还建立了脑类器官模型,以测试中和抗体治疗先天性巨细胞病毒感染新生儿的治疗潜力(Sun et al. 2020)。

在过去三年中,COVID-19大流行一直是全球的一个重大卫生问题。虽然SARS-CoV-2的主要靶点是呼吸系统,但病毒的趋向性涉及多器官系统(Liu et al. 2021)。Douaud et al. 2022;Ng et al. 2023)。近年来,已经开发了几种脑类器官模型,作为使用引导和非引导方案深入了解SARS-CoV-2在中枢神经系统中的神经侵袭的工具。Yi等人报道了在hESCs的背前脑类器官发育过程中ACE2的持续表达,并表现出对sars - cov -2假病毒感染的易感性(Yi et al. 2020)。Zhang等人还报道了ACE2、TMPRSS2和冠状病毒进入相关蛋白酶(组织蛋白酶L和furin)在hiPSCs生成的hNPCs和脑类器官中很容易获得,并表明脑类器官支持SARS-CoV-2感染和复制(Zhang et al. 2020)。Jacob等人进一步研究了区域特异性hipscs衍生的脑类器官中的SARS-CoV-2感染。使用皮质、海马、下丘脑和中脑类器官,他们报告了神经元和星形胶质细胞的有限感染,但脉络膜丛(ChP)上皮细胞的强烈感染。此外,他们从hiPSCS中开发了ChP类器官,并报告了与细胞死亡相关的产生性SARS-CoV-2感染(Jacob et al. 2020)。其他几个小组也报告了在背皮质类器官或皮质类器官中建立SARS-CoV-2感染模型。这些研究表明,SARS-CoV-2可以感染神经胶质细胞(McMahon et al. 2021;Andrews et al. 2022)、ChP细胞(McMahon et al. 2021)和神经元细胞(Zhang et al. 2020;Song et al. 2021)。Mesci等人的研究表明,神经元感染会促进细胞死亡,并伴有兴奋性突触的丧失。此外,同一组研究表明,抗病毒药物Sofosbuvir在皮质类器官模型中抑制SARS-CoV-2复制(Mesci et al. 2022)。Hou等人还利用前脑和中脑类器官研究了不同病毒变体(SARS-CoV-2 WT、Delta、Omicron BA.1和Omicron BA.2)的复制效率和嗜神经性,发现病毒感染中脑类器官多巴胺能神经元和前脑类器官皮质神经元的变异Omicron BA.2复制效率更高(Hou et al. 2022)。非导向类脑器官也被开发出来,主要用来证明病毒的细胞倾向性。根据使用指导方案的结果,各种神经细胞类型被证明对SARS-CoV-2感染敏感(Bullen 2020;Ramani et al. 2020;Tiwari et al. 2021)。另一组研究表明,脑类器官中星形胶质细胞的存在促进了神经元中的SARS-CoV-2感染,这也导致突触丧失和神经元毒性(Wang et al. 2021)。星形胶质细胞感染也与促进神经元死亡有关(Kong et al. 2022)。Pellegrini等人报道了ChP患者的SARS-CoV-2感染,伴有有限的神经元感染,可能是由于这种细胞类型中ACE2的表达水平较高(Pellegrini et al. 2020)。此外,Samudyata等人通过脑类器官模型发现,SARS-CoV-2核衣壳蛋白在PAX6、MAP2、GFAP、SOX10、OLIG2和Iba1阳性细胞中表达,并揭示了小胶质细胞在感染的类器官中增加突触后末端的吞噬,增加吞噬和突触消除的作用(Samudyata et al. 2022)。总之,脑类器官模型为研究SARS-CoV-2感染的神经元易感性、疾病机制和治疗策略提供了一个优越的平台。

未来的进步

尽管近年来出现了COs,但仍有许多需要改进的地方。CO模型的最大障碍之一是,由于缺乏营养物质和氧气向其中心扩散,它们的尺寸受到限制。在这方面的改进将允许产生更大、更复杂、更稳定的COs和类器官。这一领域目前正在以各种方式进行探索,例如生物工程特殊装置来增加扩散和类器官尺寸(即旋转生物反应器和微流控芯片)(Lancaster et al. 2013;Kim et al. 2015;Qian et al. 2016;Karzbrun et al. 2018)。另一种改善co中营养物质和氧气扩散的方法是在类器官内建立血管化。血管化不仅会增加营养物质在整个CO中的扩散,而且还会允许添加血脑屏障成分,这在神经病毒学建模中非常重要,而在脑CO中却缺乏(Miller et al. 2012)。如前所述,已经通过各种手段对类器官的血管化进行了几次尝试,并取得了不同程度的成功。血管类器官和co之间的内皮细胞共培养和组装体等方法已经取得了相对程度的成功(Pham等人,2018;Sun et al. 2022)。然而,这些协议繁琐复杂,还不是一种可靠可行的生成血管化COs的方法。因此,创建可靠和可重复的方法来生成血管化COs是一个需要探索的领域,以生成更准确的神经病毒感染模型,以及一般的人类大脑模型。也有报道称,由于各种因素,COs之间存在差异。由于遗传背景和性别差异导致的供体细胞变异性需要进一步表征,因为它们可能导致不同iPSCs品系之间的巨大差异(Burrows et al. 2016;Volpato和Webber 2020)。此外,同一系iPSCs生成的COs之间可能存在相当大的批次差异。来自同一iPSC细胞系的批次差异可能是处理、生长因子来源、培养基、设备和协议差异的结果。需要进一步改进方案和技术,以提高可靠性、可重复性和批次变化。此外,可以通过优化的多电极阵列等手段探索测量COs电生理的新方法。人类大脑的CO模型仍然是模拟嗜神经病毒感染的新时代,有无数的可能性可以而且应该被探索来改善这些系统。


目录


摘要
Three-dimensio nal (3D)脑类器官培养
有限公司 nclusions
数据可用性
参考文献
致谢

作者信息




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有限公司nclusions

3D脑类器官模型显然是优于2d细胞培养的体外平台,其组织细胞复杂性可与体内条件相媲美。人脑类器官能够在细胞、结构和发育水平上代表人脑,使研究人员能够以以前不可能的方式模拟嗜神经病毒感染。脑类器官是通过“无引导协议”开发的,允许它们自由地组织到前脑、中脑和后脑或“指导协议”中,以产生代表特定大脑区域的类器官(图1)。在过去的十年中,许多研究小组开发了各种类型的脑类器官,并模拟了主要的嗜神经病毒感染(表1)。脑类器官模型为更好地理解嗜神经病毒感染和细胞反应的分子调控提供了宝贵的知识。尽管它们被证明是体外模拟大脑的一个更好的平台,但大脑类器官也有一些局限性。它们的大小有限,由于营养物质和氧气的有限扩散,它们的中心容易发生细胞死亡。血管化尝试的改进正在进行中,结果很有希望,脑类器官3D建模的生物技术是一个快速发展的研究时代。尽管如此,3D脑类器官已经显示出它们的潜力,将体外培养系统提升到一个新的水平,并允许更好地模拟嗜神经病毒感染。

表1用于研究各种嗜神经病毒的脑类器官类型


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