2023-04-23 16:26

孕妇在怀孕期间接触超细颗粒会增加流感感染

摘要

背景

人们日益认识到空气污染与传染原之间的相互作用,对确定这两者至关重要,尤其是对保护弱势群体而言。怀孕是流感感染和空气污染暴露的脆弱时期,但怀孕期间的相互作用尚不清楚。母亲接触超细颗粒(ufp),结果

我们建立了具有良好特征的C57Bl/6N小鼠模型,从妊娠日(GD) 0.5-13.5开始每日妊娠UFP暴露,我们开展了一项试点研究,其中怀孕的水坝随后在GD14.5感染甲型流感/波多黎各/8/1934 (PR8)。结果表明,PR8感染导致过滤空气(FA)组和ufp暴露组体重增加减少。ufp和病毒感染的共同暴露导致PR8病毒滴度明显升高,肺部炎症减少,表明先天和适应性免疫防御可能受到抑制。前病毒因子鞘氨醇激酶1 (Sphk1)和促炎细胞因子白细胞介素-1β (IL-1)在肺中的表达

我们的模型的结果为孕妇在怀孕期间暴露于UFP如何增加呼吸道病毒感染的风险提供了初步的见解。该模型是建立未来保护暴露于ufp的孕妇的监管和临床策略的重要的第一步。

介绍

空气污染是全球普遍存在的环境健康问题。在全球范围内,九分之一的死亡是由空气污染造成的,每年过早死亡人数超过700万[1,2,3]。空气污染物由气体和空气中的颗粒物(PM)的混合物组成;后者通常分为超细颗粒(直径100纳米或ufp)、细颗粒(2.5米或PM2.5)和粗颗粒(10米或PM10)[4]。空气污染控制通常采用颗粒质量浓度,如美国国家环境空气质量标准或NAAQS[2]。颗粒大小在很大程度上决定了PM沿人呼吸道的沉积模式。细颗粒物已明确与各种对人类健康的不利影响有关,包括加重过敏、发展为严重慢性疾病、发展为呼吸道病毒感染和过早死亡[1,3,6,7]。脆弱人群(如孕妇)的PM暴露尤其令人担忧,妊娠期暴露于细小PM与妊娠相关并发症和不良胎儿结局的风险相关[8,9,10,11,12]。

妊娠期也被认为是易受多种病毒严重呼吸道感染的时期,包括甲型流感病毒(IAV)、呼吸道合胞病毒(RSV)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)[13,14,15]。母亲对病毒感染的易感性可以通过几个生理特征来解释,包括心排血量增加,潮气量减少,以及免疫变化,如选择性调节免疫细胞亚群来保护发育中的胎儿[16,17]。孕妇受到流感的影响尤为严重,即使在大流行期间,住院的风险也增加了10倍以上。来自流感大流行,包括2009年甲型H1N1流感大流行的流行病学证据显示,怀孕期间的发病率和死亡率都在增加,妊娠晚期的风险最明显。值得注意的是,尽管孕妇接种流感疫苗是安全有效的,但怀孕期间的疫苗接种依从性通常低于50%。截至2022年12月底,所有孕妇的疫苗接种率为46.5%。

妊娠期病毒性呼吸道感染的几个关键方面仍不确定,包括妊娠期PM暴露与呼吸道病毒之间的协同作用是否会加剧感染性、严重程度和死亡率[20,21]。此外,在标准空气质量监测中没有常规测量的ufp存在高度的暴露误分类[4,5]。大气测量表明,城市大气通常含有高浓度的ufp (bb10104颗粒cm - 3),这些ufp是由新颗粒形成以及交通和工业排放产生的[4,22,23,24]。由于ufp能够进入肺外组织并引起全身氧化应激,因此对人体健康有显著的不良影响[5,9,10,11,25,26,27]。虽然PM2.5和PM10在NAAQS中被列为标准空气污染物,但ufp对PM质量浓度的贡献可以忽略不计,因此未对暴露相关的危害进行完全分类[2,4,5]。在这项研究中,我们采用了一个全身UFP吸入模型来评估怀孕期间UFP暴露的影响(图1A)。暴露窗口(妊娠日(GD) 0.5至13.5)是基于我们之前的研究,该研究显示了对胎儿生长和后代呼吸反应的影响[11,12,28],并对易感期(即妊娠后期,感染引起的严重发病率明显)的母亲流感感染进行了修改。通过多个终点,包括体重增加、病毒滴度、肺部组织病理学和肺部前病毒和前炎症基因的表达,来评估妊娠期暴露于ufp对流感感染的易感性。已知病毒滴度在感染后3至5天达到峰值,与炎症细胞浸润的峰值一致。此外,在我们的模型中,分娩通常发生在GD18和19bb0之间。为了确保胎盘组织的收集,在接种甲型流感/波多黎各/8/1934 (PR8)后3天,对GD17.5进行尸检。总的来说,这项初步研究的结果为产妇暴露于ufp和呼吸道感染风险提供了初步的机制见解,对保护孕妇具有监管和临床意义。

图1
figure 1

实验设计和表型结果。表明驯化和交配策略的实验时间线,暴露于FA或ufp的持续时间,以及病毒感染窗口。B接种后FA(灰色)和UFP(蓝色)暴露组之间体重增加的百分比。C流感A片段7 3 '剪接位点的qPCR检测病毒滴度。D通过TCID50检测病毒滴度。数据分析采用双因素方差分析,采用Tukey多重比较检验(*p < 0.05;**p < 0.002;***p < 0.0002)

结果

妊娠期体重增加减少,病毒滴度增加最终UFP暴露和PR8感染

时间配对的C57Bl/6N怀孕小鼠(坝)在妊娠日(GD) 0.5-13.5期间暴露于过滤空气(FA)或相当于24小时平均25 g m3的ufp(附加文件1:图S1)。然后在GD14.5接种热灭活(HI)对照或活甲型流感/波多黎各/8/1934 (PR8),并在分娩前的GD17.5接种感染3天后进行评估。所有暴露组中插头阳性女性的妊娠率均≥60%。由于各组之间的怀孕率相似,暴露在辐射中不被认为会影响流产。胎儿吸收没有特征。gdp17.5组间体重增加比较。FA-HI组的体重增加百分比与单独房间的绝对对照小鼠没有显著差异(数据未显示)。暴露于FA或UFP和接种PR8的水坝的体重增加百分比存在显著差异,表明感染强劲(图1B)。两个感染组的体重增加百分比都受到影响(即FA-HI vs FA-PR8, FA-HI和UFP-PR8;N = 9/组),提示感染成功。体重增加百分比在UFP-HI与UFP-PR8或FA-PR8与UFP-PR8之间没有差异。

为了量化PR8的传染性,采用定量聚合酶链反应(qPCR)和50%组织培养感染剂量(TCID50)法测定肺内病毒滴度。编码M1和M2病毒蛋白的流感A片段7 3 '剪接位点qPCR分析显示,UFP-PR8组表达量最高,比FA-PR8组高3.7倍(p = 0.0027;图1 c)。qPCR结果也被TCID50分析证实,UFP-PR8组的PR8肺滴度比FA-PR8组高5倍(p = 0.0075;图1 d)。此外,TCID50分析显示,与FA暴露组相比,UFP暴露组出现了广泛的PR8细胞病变效应(CPE),这反映在过度的细胞圆缩、溶解和多灶细胞破坏上。PR8肺滴度的qPCR和TCID50结果表明,UFP暴露增加了病毒的复制和传染性。

表示“肺”受损免疫反应注意PR8感染

我们使用半定量评分系统评估感染后3天的肺部组织病理学。各组中最严重的情况如图2所示。总体而言,FA-HI组和UFP-HI组的大坝没有明显的炎症浸润,除了UFP-HI组的一个大坝有轻度和局灶性炎症(图2A和B)。通常,FA-PR8组的炎症更明显,(图2C)由轻度至中度的淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞和分散的中性粒细胞浸润组成。分散局限于支气管周围和血管周围区域,未累及主要气道和肺泡间隙。与HI组相似,UFP-PR8组除分散的微小淋巴细胞聚集外,未出现明显炎症反应(评分= 0)。与FA暴露相比,UFP-PR8组没有炎症浸润,提示先天免疫抑制。在严重流感感染的临床病例中,常见的组织病理学病变包括广泛的先天免疫细胞浸润(尤其是中性粒细胞),上皮内膜损伤导致水肿和透明膜形成,肺泡塌陷,这些共同诱发以弥漫性肺泡损伤和呼吸衰竭为特征的急性呼吸窘迫综合征[30,31,32]。此外,PM通过刺激IL-10信号导致免疫抑制,降低先天免疫防御,妊娠期间炎症信号的减少也导致免疫系统耐受[33,34]。

图2
figure 2

肺组织病理学。对每只动物的肺纵向切片进行两张组织学切片,包括主支气管和左右肺叶。显示平均分数的代表性区域(照片为20倍放大)。A坝暴露于FA和接种HI,未显示组织学病变(平均评分= 0)。B坝暴露于PM并接种HI,未见组织学病变(平均评分= 0.33)。C Dam暴露于FA并接种PR8,显示中度血管周围和细支气管周围淋巴浆细胞性、组织溶解性和中性粒细胞性炎症,用箭头表示(平均评分= 1.66)。暴露于PM并接种活PR8的D Dam显示支气管周围淋巴细胞数量最少(平均评分= 0)。E各暴露组肺病理评分

我们分析了每个暴露组中均质母肺样本的肺T细胞反应,包括Th1、Th2、Th17和CD8 +细胞毒性T淋巴细胞(CTL)谱系。暴露组和接种组的免疫细胞谱发生变化,提示肺部免疫抑制(图3A-F)。UFP-PR8组CD8 +细胞毒性淋巴细胞水平最低。CD8 + T细胞能够快速扩增并识别受感染的宿主细胞进行程序性细胞死亡[35,36]。UFP-PR8组中CD8 + T细胞群的减少提供了早期免疫抑制的额外证据,即使在适应性组中也是如此,这与PR8肺滴度升高和组织病理减少相一致(图1和2)。在我们的研究中,T细胞亚群之间缺乏显著差异可能可以解释为狭窄的感染窗口,我们选择在分娩前进行评估。流式细胞术数据变化较大,似乎需要进一步调查才能得出肯定的结论。T细胞对流感感染的动力学已经在小鼠和人类中得到了描述[37,38]。通常情况下,iav特异性CD8 + T细胞在感染后0 - 2天保持在基线水平,随后在感染后4天在肺部进行单一增殖周期,随后在感染后5-9天快速扩增。同样,CD4 + T细胞反应在感染后7-9天才达到峰值。

图3
figure 3

分离肺组织的肺T细胞谱。CD8 + T细胞计数显示,与所有其他组相比,UFP-PR8组明显减少。B CD4 + T细胞计数。C属于Th1谱系的CD4 + T细胞计数(IFN- +)。D属于Th2谱系(IL-4 +)的CD4 + T细胞计数。E肺中Th1/Th2细胞比例,用作免疫系统偏向的指标。F属于Th17谱系(IL-17 +)的CD4 + T细胞计数,与FA-PR8组相比,UFP-PR8组略有减少

促病毒和促炎基因ex的动态变化压力

我们通过qPCR检测了肺中的几个基因,包括转录因子、编码炎症细胞因子的基因和免疫细胞特异性基因(图4)。这些转录因子,包括Sphk1基因和Il-细胞因子基因,在先天免疫反应中诱导髓细胞发挥重要作用。在5个基因中观察到可检测的表达(图4A-E)。Sphk1与PR8肺滴度呈中等强正相关(图4A和Il-1β(图4B);Irf7、Tgf-β和Il-33的相关性很小(图4C-E)。Sphk1和Il-1β表达的增加与病毒滴度的增加一致(图1C-D)。与FA-PR8组相比,UFP-PR8组Sphk1的表达增加了约5倍(p = 0.0171;图4)。Sphk1是一种激酶的编码基因,控制细胞分化和凋亡,在感染流感后通过调节病毒RNA的合成和病毒核糖核蛋白复合物的输出,是一种重要的前病毒因子。在严重的流感感染病例中,Sphk1的水平和活性有所增加,促进流感的复制。与FA-PR8组相比,UFP-PR8组Il-1表达显著升高(p = 0.0377;图4 b)。Il-1是炎症反应的关键介质,对宿主的反应和对病原体的抵抗至关重要[39,40,41]。尽管这种促炎信号细胞因子的高表达,但缺乏肺部炎症的证据,这表明它的表达并不是信号免疫效应细胞对PR8早期消退的重要作用。

图4
figure 4

暴露组间Sphk1的促病毒和促炎基因A表达调控,其中UFP-PR8组表达最高;相关分析显示与病毒滴度呈正相关(R2 = 0.8366)。暴露组间Il-1β的表达,以UFP-PR8组表达量最高;相关性分析显示与病毒滴度呈正相关(R2 = 0.6287)。暴露组之间Irf7的C表达,与病毒滴度无显著变化或相关(R2 = 0.02653)。Tgf-β D表达在暴露组间无显著变化或相关性(R2 = 0.1602)。各组间Il-33 E表达与病毒滴度无显著变化或相关性(R2 = 0.1052)。

考虑到怀孕期间对感染的易感性,我们对胎盘中的几个基因进行了转录分析,为可能导致肺部易感性的全身因素提供了额外的背景。我们评估了基质金属蛋白酶9 (Mmp9)、环氧化酶2 (Cox-2)、胎盘源性生长因子(P1gf)、前列腺素E合成酶2 (Pges2)、黄体酮诱导阻断因子(Pibf)和血管内皮生长因子(Vegf)的表达。Mmp9切割多种蛋白来调节对炎症和损伤的反应,Mmp9表达的增加与H1N1病毒滴度[42]呈正相关。Cox-2是一种免疫应答性激素调节剂,在h1n1感染的妊娠小鼠[43]中被证明是失调的。PGE2催化前列腺素E2 (PGE2)的合成,前列腺素E2是一种重要的脂质介质,有证据表明可以抑制IAV的先天免疫反应;Pibf是一种黄体酮敏感的免疫调节基因,可促进Th2细胞因子的产生和抑制NK细胞[44]。Vegf调节血管、炎症、重塑和细胞死亡,促进胎盘血管的改变,但也在肺生理中发挥作用。虽然有5个基因显示可检测的表达,但在任何暴露组的任何性别胎盘之间没有观察到基因表达的显着差异(附加文件1:图S4)。

母体感染未影响胎儿指标。

我们检查了所有暴露组中每个胎儿的终点,包括胎儿体重、胎儿冠臀长、胎盘重量和胎盘效率(附加文件1:图S3)。在UFP-PR8暴露组中,除了男性和女性胎盘效率下降的趋势外,胎儿测量没有明显的模式,没有统计学意义上的变化。


目录


摘要
介绍
结果
讨论
方法
数据和材料的可用性
参考文献
致谢

作者信息
道德声明

补充信息



#####

讨论

控制空气污染与呼吸道病毒感染严重程度之间相互作用的因素是复杂的、多因素的,结合了毒理学、免疫学和个体生物学的各个方面。这些相互作用也可能取决于吸入颗粒的沉积特性和化学性质。由于ufp在城市环境中的丰度很高,并且能够深入人体并引起全身氧化应激[4,5,21,22,23],因此ufp可能对孕妇的健康产生深远的不良影响(图5)。先前的研究表明,产前暴露于ufp与死胎、低出生体重、不良器官发生以及呼吸、认知、以及与孕期和产后生长发育相关的心脏代谢功能障碍[9,10,11]。我们的小鼠模型提供了多种支持证据,证明妊娠期UFP暴露增强了对流感感染的易感性,显示体重增加减少(图1B),病毒滴度升高(图1C-D),肺部炎症和T细胞反应减少(图2和3),炎症介质下调和前病毒因子上调(图4)。虽然促炎介质Il-1β在UFP- pr8组中升高,但抗病毒炎症在很大程度上受到抑制。基于肺部没有炎性细胞浸润。尽管Il-1β升高,但炎症细胞浸润的缺失对感染的早期解决至关重要,表明炎症趋化信号的缺失。

图5
figure 5

在我们的模型中观察到的ufp来源和对流感感染严重程度的影响示意图。在城市环境中,大量高浓度的UFPs直接从交通和工业来源排放到大气中,和/或由与光化学氧化有关的新颗粒形成产生,这是由羟基自由基(OH)或臭氧(O3)引发的,涉及挥发性有机化合物(VOCs)和二氧化硫(SO2)在氮氧化物(NOx = NO + NO2)和氨(NH3)存在下4,20 - 22。我们的小鼠模型显示了孕妇暴露于UFP后呼吸道感染加重的四个主要不良健康影响:(1)体重增加减少,(2)肺部免疫反应降低,(3)病毒滴度升高,(4)促病毒和促炎症基因表达增强

体重增加是健康妊娠进展的关键标志,在病毒模型中是感染严重程度的指标。体重增加不足与婴儿死亡、未能开始母乳喂养和早产的风险增加有关。先天免疫效应细胞,包括中性粒细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞,是抵抗入侵病原体的第一线防线,在UFP-PR8组的组织病理学病例中基本没有。先天免疫细胞也起到免疫系统适应性臂的信号作用,以T辅助细胞和CD8 + ctl为主。具体来说,中性粒细胞在感染时在气管中铺设轨道来引导CD8 + ctl,而无效的信号传导导致CD8 + T细胞募集缺陷[46]。先天和适应性免疫细胞亚群,尤其是CD8 + ctl,在有效的病毒清除中都是不可或缺的,活性的降低对应于抗病毒活性和宿主防御[47]的降低。在我们的初步研究中,均质肺样本中Th1、Th2、Th17和CD8 + T细胞的分析显示免疫细胞谱发生了变化。因此,病毒滴度的增加证实了肺部早期先天和适应性免疫反应的减少。此外,怀孕期间母体免疫系统的调节可能会影响对病毒感染的反应。改变的炎症反应的特征是CD4 + T细胞群向Th2免疫表型转移,而不是Th1免疫表型(Th1/Th2“转移”)。Th1反应性降低会影响被感染细胞的清除。孕酮水平的增加已被证明会降低病毒特异性抗体水平和流感特异性CD8 + t细胞。免疫功能的其他变化,包括循环自然杀伤(NK)细胞的减少,也暗示了怀孕期间宿主易感性的增加。这强调了调查一个全面的免疫系统小组对充分表征感染严重程度和风险bbb的重要性。

UFP-PR8组Sphk1和Il-1β显著升高与病毒滴度和感染严重程度呈正相关。有趣的是,Vose等人观察到Sphk1转录物水平的降低,这与暴露于木材烟雾颗粒(WSP)并随后感染PR8的未怀孕小鼠中观察到的病毒滴度降低相关。这表明,WSP可以降低Sphk1水平作为一个下游效应,但这并没有最终确定。不同的PM成分或暴露因素,即怀孕,可能解释这些不同的结果。先前的研究表明,怀孕小鼠对不同颗粒的反应存在差异。例如,Fedulov等人的研究表明,与未怀孕的小鼠相比,怀孕增强了对TiO2颗粒的炎症反应[49]。相反,Thaver等人证明怀孕降低了对二氧化硅的炎症反应,改变了对柴油废气PM的免疫反应,增加了对PM暴露的CD4+CD25+T细胞的比例。这些发现强调了表征颗粒大小和组成的重要性,以调查怀孕期间的独特影响。考虑到妊娠期对感染的高易感性,我们对胎盘中的几个基因进行了转录分析,以提供可能导致肺部易感性的全身因素的额外背景。尽管已知这些基因与流感感染相关,但未观察到任何被检测基因的显著增加或减少。我们将此归因于研究中使用的狭窄感染窗口。

我们的模型是一个有用的开始,可以梳理出怀孕期间ufp的影响。我们的研究确实有一些局限性。首先,我们的模型只研究了单一剂量水平的ufp,在24小时内为25 g/m3。这一剂量水平低于EPA的PM2.5标准,该标准的指导方针是24小时98百分位形式,浓度为35 g/m3,作为一级和二级标准[51]。我们的研究使用25 μg/m3 ufp剂量,持续6小时,持续13天,然后进行为期三天的感染挑战。虽然我们的剂量确实接近监管标准,但有必要增加超过监管标准的替代剂量水平,以确定ufp与PR8病毒感染之间的剂量-反应关系。第二,我们的感染窗口比较窄。选择一个狭窄的3天感染窗口是基于这将是一个足够的先天免疫激活时间,并确保在GD18.5或gd19.5自然分娩前收集组织。然而,限制性窗口可能解释了暴露组和接种组之间缺乏更多实质的组织病理学病变。与这一观察结果一致的是,各组之间的T细胞谱缺乏显著变化,这需要进一步的研究。先天免疫效应细胞,包括巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞和树突状细胞,未被检测。在未来的模型扩展这项工作,需要一个全面的流式细胞仪面板。此外,有文献表明,母亲流感感染可通过组织特异性激素失调导致不良妊娠结局和促流产机制,这在我们的研究中并不明显。因此,未来的模型延长感染期是必要的。

总的来说,我们的结果是一个重要的开始,分别支持临床和监管干预措施,以保护孕妇和控制ufp。必须为城市孕妇提供疫苗接种,因为流感和ufp是城市的共同热点。此外,低收入和少数民族人口更有可能居住在交通和工业相关的UFP来源附近,污染暴露、种族和社会因素的综合脆弱性对环境正义和公平构成了重大挑战。为保护产妇健康,有必要采取预防措施,限制UFP暴露并促进疫苗接种。

方法

动物和暴露

繁殖

雄性和雌性C57Bl/6N 8至10周龄小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine)在德克萨斯州A&M基因组医学研究所的AAALAC批准的设施中保持12小时的明暗循环和交配时间。根据德克萨斯农工大学机构动物护理和使用委员会# 2019-0025,遵循了所有批准的协议。在控制条件下(12/12 h明暗循环,18-23℃,50%湿度),每笼2只雌性小鼠饲养于玉米芯铺垫的聚碳酸酯笼中。雄性繁殖者以类似的方式每笼饲养一只。小鼠被给予标准食物,19%蛋白质挤压饮食(9%脂肪)和水,除了暴露期间。经过两周的住房室适应期后,雌性小鼠适应吸入暴露室,每天6小时,持续1周,以减少因压力而导致暴露相关的妊娠损失的可能性。雌性也在交配前另外两天适应阴道细胞学。为了确定发情周期,将20 L PBS注射到阴道内,快速抽吸,并检查抽吸物以评估存在的细胞。确定处于发情期或发情期的雌性被分开交配。晚上,雌性与雄性合住,第二天早上出现交配塞被指定为妊娠日(GD) 0.5。记录初始体重,并将水坝随机分配到过滤空气(FA)对照组或PM暴露组。在接触和感染期间,每天评估母亲的体重。

超细颗粒物暴露

按照Behlen等人和Lau等人先前的描述进行PM暴露[12,27,53]。小鼠(n = 18);n = 18 (ufp))在全身吸入室中从GD0.5到13.5暴露6小时/天。简单地说,hepa过滤的空气被连续泵入FA和UFP室。水泵运行时产生的噪音可忽略不计。采用恒输出雾化装置制备由硝酸铵、硫酸铵、柴油烟尘(NIST, SRM 2975)和氯化钾组成的UFP气溶胶。采用差分迁移率分析仪(DMA)和冷凝颗粒计数器(CPC)实时监测颗粒大小分布和计数。监测UFP室,并相应地调整hepa过滤空气的流量,使颗粒浓度在整个研究过程中保持在~ 100 g/m3。这一剂量是基于先前观察到的对后代健康的影响[12,27,53]。此外,该剂量相当于24小时平均暴露25 g/m3,刚好低于EPA PM2.5规定水平(35 g/m3)。在暴露时间结束时,根据体重增加判断没有怀孕的水坝要么被送回繁殖池(FA暴露),要么被安乐死(UFP暴露)。被判断为怀孕的母鼠被转移到ABSL2套房以感染流感。

病毒的挑战

在暴露于FA或ufp后,大坝在德克萨斯州A&M实验室动物护理中心过夜。第二天,将小鼠置于轻度异氟醚麻醉下,用6.2 × 104 pfu的甲型流感/波多黎各/8/1934 (PR8)活病毒或热灭活(HI)对照剂鼻内接种,总体积为20 mL。总共有四个暴露组:FA-HI、FA-PR8、UFP-HI和UFP-PR8 (n = 9/组)。选择该剂量是为了模拟严重的人类流感感染病例。PR8由Robert Tighe博士(杜克大学)提供,病毒库存和对照如前所述[54,55]生成。监测大坝是否有任何窘迫的迹象,包括呼吸困难、驼背、眼眶紧绷和体重过度减轻。感染后3天(3 dpi),将小鼠分配到三个尸检组中的一个:病毒载量和抗病毒qPCR(肺在液氮中冷冻),组织病理学(肺在25厘米的恒压下膨胀并用福尔马林锌固定),或流式细胞术(肺处理成单细胞悬液)[28]。雌性小鼠腹腔注射戊巴比妥200 mg/kg安乐死。

在切除肺后,剖开每只孕鼠的腹部和腹膜,将腹部器官移到一边,以观察子宫和卵巢。定位每个角的输卵管和子宫输卵管连接处远端的卵巢,在子宫输卵管连接处切开,将子宫角与含有子宫血管的肠系膜分开。为了分离每个胚胎,在植入间区域做横向切口。从每个胎儿身上取下胎盘和蜕膜组织。测定冠臀长(CRL)、胎儿体重和胎盘体重,并进行性别区分。胎盘被快速冷冻,直到用于转录分析。

表示“肺”连组织病理学

肺(n = 3/组)在福尔马林中固定24-48小时。组织横向切割并转移到70%乙醇中保存,直到包埋并用苏木精和伊红(H&E)染色以识别细胞浸润。所有组织学评估均由一名解剖病理学家对治疗组进行盲法。使用如下评分系统对炎症严重程度进行评分:0(无至最低),1(轻度),2(中度)和3(标记)。

表示“肺”流式细胞术

肺(n = 3/组)灌注无菌PBS以消耗红细胞,并加工成单细胞悬液进行流式细胞术,如前所述[27]。分别用CD3、CD8、CD4、IFN-γ、IL-4和IL-17抗体染色细胞,检测CD8 +和CD4 + Th1/Th2/Th17的反应。T细胞染色采用单克隆Alexa Fluor (AF) 488抗小鼠CD3, PE抗小鼠CD69。Th1染色采用单克隆AF 647 IFN-γ、APC/Fire 750抗小鼠CD4和PE/Cy7抗小鼠CD8a。Th2染色采用单克隆BV421抗小鼠IL-4。Th17染色采用单克隆AF 488抗小鼠IL-17A。免疫染色细胞(10,000个/样本)在Luminex/Amnis细胞流式细胞仪上分析,如前所述[27]。流式细胞术数据采用Cell Stream分析软件(Luminex/Amnis)进行分析。附加文件1报道的流式细胞术门控策略:图S2。

表示“肺”无病毒载量

收集肺样本进行病毒载量测定(n = 3/组),通过TCID50测定或qPCR进行评估。在TCID50实验中,将MDCK细胞(ATCC, CCL-34)的96孔板在标准DMEM培养基中培养,添加10%胎牛血清、1%抗生素和抗真菌药、L-谷氨酰胺和3.7 g/L碳酸氢钠。如前所述,肺样本在PR8流感感染培养基中均质。MDCK细胞96孔板第一柱接种10 L肺匀浆,其余柱依次接种10倍稀释的匀浆。最终孔体积为200 l,培养皿孵育5天或至培养皿第一柱的所有孔均有明显的细胞病变效应(CPE)。对于qPCR,使用TRIzol方法从肺样本中分离RNA。分离后测定RNA纯度。拒绝RNA量为200 ng/ L或A260/A280比低(1.6)的样品,制备新的RNA样品。从1µg总RNA (Qiagen quantiect®Reverse Transcription Kit, Cat #205,311)合成互补DNA,并在罗氏LightCycler®96 PCR机上使用PowerSYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Cat #4,367,659)进行qPCR。制备主混合物,包括PR8片段7 3’剪接位点基因的引物。以Gapdh作为内参基因。没有模板对照(ntc)和逆转录对照(- RT)作为所有基因和样本的阴性对照。采用[57]法测定相对基因表达量。

抗病毒基因压力分析

用于病毒载量测定的肺样本(n = 3/组)也用于抗病毒qPCR评估。为了确定PM对流感PR8感染抗病毒反应的影响,对抗病毒反应不可或缺的另一组基因进行了评估。每个基因的引物报告在附加文件1:表S1中。分析的基因包括编码参与趋化信号和炎症反应的常见抗病毒细胞因子(Tgf-, Il-1, Il-33)的基因,以及参与调节干扰素反应和病毒子代产生的上游转录因子(Irf5, Irf7, Stat4, Sphk1)的基因。对经典活化巨噬细胞的标志物Nos2也进行了评估。采用此方法测定各组间基因相对表达量,归一到FA-HI对照[57]。引物序列报告在附加文件1:表S1中。

胎盘基因压力分析

为了确定ufp对胎盘中可能导致肺部对流感易感性的细胞因子和激素的影响,在所有阳性妊娠的尸检中收集胎盘,称重并进行性别分离。胎盘集中在窝中(每个暴露组每性别n = 3个胎盘);每个暴露组N = 3窝)。分析的基因包括Mmp9、酶编码基因(Pges2、Cox-2)和生长因子(P1gf和Vegf)。引物序列报告在附加文件1:表S2中。

统计分析

所有统计分析均使用GraphPad Prism (v9.2.0)进行,并以mean±SEM表示。表型分析采用双因素方差分析(ANOVA)和Tukey多重比较检验。p值< 0.05认为检验具有统计学意义。



Download: