2023-04-27 13:00

共同暴露于超细炭黑和臭氧后肺-肠轴微生物组的改变

摘要

背景

微生物生态失调是空气污染引起不良后果的潜在中介。然而,对空气污染暴露后肺和肠道微生物组变化和肺-肠轴的系统比较缺乏。在本研究中,我们将雄性C57BL/6J小鼠暴露于吸入空气、CB (10 mg/m3)、O3 (2 ppm)或CB + O3混合物中,连续1天或4天,每天3小时,最后一次暴露24小时后安乐死。肺和肠道微生物组通过16s测序进行定量。

结果

多次暴露于CB + O3诱导肺部炎症细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和B淋巴细胞)增加,肺部绝对细菌负荷减少,肠道负荷增加。CB + O3暴露更有效,因为它在单次暴露后降低了肺部微生物组的α多样性。CB + O3共暴露惟一地增加了肺部的梭菌科和普氏菌科。血清短链脂肪酸(SCFA)(醋酸酯和丙酸酯)仅在CB + O3共暴露后显著升高。在多次暴露后,在肠道中也观察到产生SCFA的细菌家族(Ruminococcaceae, Lachnospiraceae和真细菌)的显著增加。共暴露诱导了肠道代谢物受体/介质(Gcg, Glp-1r, Cck) mRNA表达的显著改变。暴露于CB + O3后,肺中氧化应激相关mRNA表达、BALF、血清和肠道中氧化剂水平显著升高。

结论

我们的研究证实,在吸入CB + O3共同暴露后,肠道和肺部微生物组发生了明显的变化,并表明肠道微生物组可能发生稳态改变,以对抗环境暴露对代谢系统的有害影响。

介绍

空气污染是最严重的环境健康威胁之一。空气污染每年造成650多万人死亡。2020年,美国约有1.34亿人暴露在不健康的颗粒物(PM)中。空气污染的各个组成部分(PM, O3, NOx-氮氧化物)的毒性已经得到了很好的确定,并形成了当前监管决策的基础。然而,空气污染的不同组成部分之间的相互作用结果尚未得到很好的确定。我们之前报道过,臭氧(O3)和炭黑(CB)吸入共暴露可诱导更大的肺损伤和炎症以及巨噬细胞驱动的内皮细胞损伤[4]。在我们的研究中,我们使用炭黑作为超细PM碳芯的替代品。超细炭黑可通过直接或间接的机制诱发显著的遗传毒性、肺毒性和发育毒性[b]。另外,臭氧是空气污染的主要成分,是紫外线与不同污染物(如挥发性有机物、氮和硫氧化物)相互作用产生的[5,6]。O3在人和动物模型中诱导肺部炎症[7,8]。尽管单独的臭氧和PM暴露与已有的呼吸系统疾病(如COPD和哮喘)之间存在明确的关联[9,10],但最近的流行病学研究表明,潜在的协同作用和相互作用结果bbb。以往的PM和O3共暴露研究主要关注心血管结局,很少关注呼吸结局[12,13,14,15,16,17,18,19,20]。

微生物组被定义为在特定环境中共存的遗传物质的集合。微生物组调节多种重要的生理反应,包括多糖消化、营养物质产生、病原体逃避、解毒和免疫调节[22,23,24]。呼吸道微生物组是动态的,由鼻咽气道、上呼吸道和下呼吸道微生物组组成。呼吸道微生物组的组成受到多种因素的影响,如遗传、环境暴露、免疫状态和既往感染[25,26]。呼吸道微生物群组成的改变与多种呼吸道疾病有关,如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、特发性肺纤维化(IPF)和囊性纤维化(CF)[27,28,29]。只有少数研究考察了空气污染暴露引起的肺反应中的微生物组动力学[30,31,32,33]。同样,空气污染暴露对肠道微生物群的影响直到最近才引起人们的关注,肺部和肠道微生物群之间可能存在双向联系。大多数已发表的证据都集中在肺或肠道微生物组上,只有少数研究确定了同一动物肺和肠道微生物组的变化[35,36,37]。暴露于柴油废气颗粒(DEP)会引起全身炎症和肠道放线菌、变形菌和Verrucomicrobia[38]的改变。此外,ApoE敲除小鼠暴露于PM后,观察到显著的微生物变化、宿主代谢物的改变和肠道通透性。PM暴露会导致微生物生态失调、呼吸功能障碍加剧、急性呼吸窘迫综合征和炎症性肠病[40,41,42]。然而,这些研究是使用空气污染的单个颗粒或气体成分进行的,并且现实颗粒和气体混合物吸入模型的影响仍然没有报道。对单个生物体的肺和肠道微生物组进行分析,可以更准确地建立肺-肠轴。它还可以减少多种混杂/人为因素,如住房和处理/压力,可以影响微生物组的结果[43,44,45]。这也减少了个体/动物间变异性的影响,从而产生了更可靠的数据。

我们最近报道了反复吸入超细CB和O3导致肺损伤和进行性线粒体功能障碍[3]。本研究旨在确定雄性C57BL/6J小鼠单次或多次吸入暴露后肺部和肠道微生物组的变化。我们假设吸入共暴露于超细炭黑和臭氧会诱导肺部和肠道中独特的微生物组改变。我们还试图确定由共同暴露引起的独特变化,以确定共同暴露的影响。此外,我们将血清SCFA含量和氧化/抗氧化平衡的差异定义为微生物组诱导的肺部和全身改变的潜在全身介质。

材料与方法

暴露系统和气溶胶特性

设计了一个全身吸入暴露系统,将动物暴露于炭黑(CB)、臭氧(O3)或CB + O3混合物的气溶胶中。曝光系统先前已详细介绍过。简单地说,散装CB (Printex 90,作为礼物由Evonik,德国提供)雾化与高压声波发生器(HPAG, IEStechno, Morgantown, WV)。利用文丘里泵(JS-60M, Vaccon, Medway MA)进一步对HPAG的输出进行脱聚。采用光散射装置(DataRAM, pDr-1500, Thermo Environmental Instruments Inc, Franklin, MA)实时监测颗粒数浓度(mg/m3)。将纯氧通过电晕放电的O3发生器(HTU500AC, Ozone Solutions, Hull, IA)产生O3。使用校准过的O3监测器(202型,2B Technologies, Inc., Boulder, CO .)实时监测O3水平。在共暴露过程中,将生成的O3与CB混合,并引入150 L不锈钢暴露室(Cube 150, IEStechno, Morgantown, WV),每个不锈钢网箱最多容纳36只小鼠。使用自动反馈回路监测并维持CB和O3水平在预定水平。在整个暴露过程中监测并保持温度(20-22°C)和湿度(50-70%)。从暴露室中测量粒径分布,使用(1)低压冲击器(ELPI+, Dakati, Tempera,芬兰),(2)气溶胶粒度仪(APS 3321, TSI Inc Shoreview, MN), 3)扫描迁移率粒度仪(SMPS 3938, TSI Inc.)。4)纳米微孔均匀沉积冲击器(Moudi 115R, MSP公司,Shoreview, MN)。使用场发射扫描电子显微镜(Hitachi S4800, Tokyo, Japan)和透射电子显微镜(JEOL JEM-2100 TEM)观察雾化颗粒的形貌。

小鼠模型

所有的动物实验都得到了西弗吉尼亚大学(WVU)动物保护和使用委员会的批准。C57BL/6J雄性(8-10周龄)小鼠购自Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME),暴露前在WVU动物护理设施驯化7天。将小鼠饲养在HEPA过滤的笼子中,随意提供食物和水,维持12 h的明暗循环。动物饲养在社会住房(5只/笼)。暴露期间,小鼠被单独安置在钢网笼中(每次暴露3小时)。在整个暴露过程中监测并保持温度(20-22°C)和湿度(50-70%)。小鼠在周一至周四每天早上7点开始暴露。给小鼠随意提供食物和水,维持12 h的光/暗循环。小鼠随机分为四组:(1)对照/过滤空气,(2)CB (10 mg/m3), (3) O3 (2 ppm)和(4)CB + O3 (10 mg/m3 + 2 ppm)共暴露。暴露在WVU iTOX吸入设施中进行。动物每天暴露3小时,每天一次或每天一次,持续4天,每天监测体重,并在附加文件1:图S1中报告。小鼠在最后吸入暴露24小时后腹腔注射致死性药物(250 mg/kg)安乐死。暴露示意图如图1A所示。

图1
figure 1

肺部炎症的研究布局与分析。A动物暴露实验平面图。B热图显示免疫细胞谱的改变。C57BL/6J小鼠(8-12周)分别暴露于空气、CB (10 mg/m3)、O3 (2 ppm)或CB + O3中3小时,分别为1次或4次暴露,最后一次暴露24小时后安乐死。数据以均数±均数标准误差(SEM)表示,并通过双向方差分析(ANOVA)进行分析,然后进行Tukey事后检验。LSRFortessa II肺组织均质、染色和分析。n = 3-5。*p≤0.05。*表示与空气有显著差异,#表示同一时间点与O3有显著差异,$表示单暴露组与多暴露组有显著差异

兄弟肺泡灌洗分析

安乐死后,通过注射器将约1ml冰冷的无菌PBS经气管注入肺部三次,获得约3ml支气管肺泡灌洗液(BALF)。BALF在4℃下以600 RPM离心5 min,收集BALF上清,保存于- 80℃,供后续实验使用。

流式细胞术

安乐死后,新鲜采集的肺组织用于流式细胞术分析。简单地说,将肺充气并收集在消化缓冲液中,该缓冲液由DMEM (Dulbecco 's Modified Eagle Medium) F-12 (Gibco)组成,其中含有dna ei (0.33 U/mL, Sigma Aldrich),疾病(5 U/mL, Gibco)和胶原酶I (450 U/mL, Roche)[46]。切开肺,在37°C消化培养基中周期性摇动培养20分钟。孵育结束时,在细胞中加入10% DMEM F-12 (Gibco),通过70 μM尼龙网获得单细胞悬液。使用RBC裂解缓冲液(BD Biosciences)进行红细胞裂解,在室温下黑暗中培养细胞5分钟。使用伯爵夫人细胞计数器(Invitrogen)对单细胞悬液进行计数。对大约200万个细胞进行标记,用活力染料(FITC)染色,用FcRBlock (Miltenyl Biotec)孵育,并用荧光染料偶联抗体混合物染色。使用BD FACSDiva软件在BD LSR Fortessa II上获取数据。通过FCS Express 7 (De Novo Software, Glendale, CA)进行分析。门控策略和炎症细胞鉴定程序以及各自的克隆和供应商在附加文件1中定义:图S2。

DNA隔离

使用Qiagen DNeasy Blood and Tissue试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)按照制造商的方案,在-80°C下粉碎后,从肺和结肠内容物(后来定义为肠道)中提取基因组DNA。在高生物量标本(肠道)之前收集低生物量标本(肺)进行16s rRNA测序。为避免微生物污染,使用不同的仪器采集肺和肠标本。使用Nanodrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)测量DNA浓度和纯度。标本按随机顺序处理,以尽量减少因试剂污染而形成假阳性模式的风险。所有试剂均来自无菌和分子生物学级制剂。

16s rRNA基因测序及DNA定量

利用KAPA HiFi HotStart PCR试剂盒(KAPA Byosystems, Wilmington, MA, USA)扩增16S rRNA基因的V3-V4区域,分析微生物DNA。PCR反应的组成包括:1X KAPA HiFi Fidelity Buffer, 0.5 mM MgCl2, 0.3 mM KAPA dNTP Mix, 0.3 μM引物,0.5 U KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase, 15 ng DNA模板。PCR程序包括以下步骤:95°C初始变性3 min, 98°C变性20 s, 63°C变性30 s, 72°C变性30 s, 72°C扩增5 min。PCR产物用KAPA纯珠(KAPA Byosystems, Wilmington, MA, USA)用Magnetic Stand-96 (Thermo Fisher Scientific)纯化。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行质量控制。使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒(Illumina)和KAPA HiFi HotStart PCR试剂盒进行Index PCR,方法如下:1X KAPA HiFi Fidelity Buffer, 0.5 mM MgCl2, 0.3 mM dNTP Mix (KAPA), 0.3 μM引物,0.5 U DNA聚合酶(KAPA HiFi HotStart), 5 μL Index 1引物和Index 2引物(Nextera XT)每个样品。PCR程序包括以下步骤:95°C初始变性3 min, 95°C 30 s, 56°C 30 s, 72°C 30 s 22个循环,72°C 4 min为最终延伸。该程序按照16S宏基因组测序库制备指南进行。文库产物纯化为PCR产物。使用Qubit 3.0荧光仪(Thermo Fisher Scientific)测量最终DNA浓度。这些浓度用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies, CA, USA)进行验证。将纯化后的产物稀释至终浓度为4 nM。按照文库制备指南(The 16S宏基因组测序文库制备指南),将混合纯化产物变性,装入样品分析,终浓度为7pm。使用Illumina MiSeq系统(Illumina)对16S rRNA基因文库进行2 × 300对末端reads测序。

序列质量评价与生物信息学分析

fastq格式的微生物组样品使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME2, version 2020.11)管道[47]进行处理和分析。FastQC用于检测fastq文件[48]的质量。在QIIME2环境中,使用MiSeq Reporter对2 × 300 bp的成对末端读取进行解复用。利用DADA2管道[49]对序列进行处理,对微生物组分进行分类。序列通过去重复、去噪、合并和去除嵌合体等顺序处理。DADA2中的FilterAndTrim函数使用标准参数(maxN = 0, truncQ = 2, maxEE = 2)进行序列滤波。使用SILVA (version 132)数据库以99%相似度[51]对特征进行开放参考聚类和基于参考的嵌合体过滤。用稀疏曲线分析来估计微生物群落取样的完整性。根据生成的分类法,对特征表进行过滤,只包括指定的细菌王国的读取,并删除单个特征。操作分类单位(otu)用维恩图表示。比较各组间Shannon和Simpson指数。采用Bray Curtis指数、Jaccard距离矩阵和Unweighted Unifrac系统发育距离矩阵来评估Beta多样性[52,53,54,55]。生成二维原理协调分析图,以可视化细菌群落分析。采用999个随机排列的PERMANOVA (α = 0.005)来确定组间差异。

细菌负荷定量

使用Qiacuity数字PCR系统(Qiagen, Hilden, Germany)对肠道和肺部基因组DNA中的细菌总DNA、厚壁菌门和拟杆菌门负荷进行定量。引物序列见附加文件1:表S1。循环条件设置为95°C 2 min(循环1),然后在95°C 15 s, 60°C 15 s, 72°C 15,然后在35°C 10 min下进行1个循环(40个循环)。非模板对照与标本一起运行。根据阳性和阴性RFU人群计算阈值。细菌负荷以每ng DNA的拷贝数表示。

短链脂肪酸的制备与分析

三种主要短链脂肪酸(SCFA)(醋酸酯、丙酸酯和丁酸酯)用血清样品测定。在1.5 mL微离心管中,将100 mM PFBBr丙酮溶液400 μL加入50 μL血清中制备样品,进行GC/MS分析。每个样品加入4 μL的巴豆酸溶液,用PBS稀释100X。同样,将100 mM PFBBr丙酮溶液400 μL加入24 μL C2、C3和C4的混合物中制备标准品。将样品和标准品(各4 μL)转移到2 mL自动进样玻璃瓶中,在70°C干浴中孵育1 h。孵育后,样品和标准品冷却5分钟,在自动进样器小瓶中的样品中加入1ml己烷。将样品和标准品转移到新的1.5 mL微离心管中,旋转5 min,在300 RCF下离心1 min。将上相(己烷相)200 μL转移到玻璃GC小瓶中进一步分析。

GC/MS数据在配备7890A GC系统的5975C MSD上获得。分离在DB5-MS柱(30 m × 0.25 mm × 0.25um)上进行,从60°C开始0.1 min,升温10°C/min至280°C。样品(2 μL)以无分裂方式注入。以甲烷为化学电离气体,得到了负化学电离光谱。源、四方温度均为150℃。同时获得全扫描和选择性离子监测(SIM)。在50-100 μ m范围内进行全扫描。用于SIMS的离子分别为57、73、87和85。积分方法为SIM离子感兴趣峰面积/SIM 85峰面积(内标)之比。稀释后的标准品被用来制作标准曲线,用于单个样品的定量。

RNA分离/实时PCR

从组织匀浆(肺)中分离RNA,在mRNA水平上分析基因表达。按照制造商的说明,使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)分离总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(High-Capacity cDNA Reverse transcription Kit)进行反转录,并使用无核酸酶水稀释至工作浓度为10 ng/µL。采用AriaMx实时PCR系统(Agilent, Santa Clara, CA)进行实时PCR。每个PCR反应混合物含有Syber Green®12.5µL, cDNA 5µL,引物3µL,无核酸酶水2µL,总体积22.5µL。采用Aria Real-Time PCR软件,以18S为内参基因,采用比较阈值法测定相对表达量。使用2−ΔΔCT方法分析数据(Livak和Schmittgen. 2001)。PCR引物序列见附加文件1:表S1。

电子顺磁感应荧光(EPR)光谱

如前所述,使用1-羟基-3-羧甲基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷(CMH)自旋探针(Enzo Life Science),通过EPR光谱测量小鼠血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)和组织(按重量归一化)的氧化电位[4,56]。EPR光谱使用布鲁克ELEXSYS E580光谱仪(布鲁克生物科学公司,Billerica, MA, USA)记录,工作在x波段,调制频率为100 kHz。

简单地说,血清/BALF样品和重量归一化的组织匀浆在37℃下用EPR自旋探针CMH (200 μM)孵育30分钟。CMH (EPR无活性)被血清/BALF/组织中的活性/氧化物质氧化成EPR活性的3-羧甲基-2,2,5,5-四甲基-吡咯烷二氧基自由基(CM•;)。孵育后,样品在液氮中快速冷冻并保存在- 80°C,直到EPR分析。在EPR测量时,将冷冻样品解冻至室温,并立即将(50 μL)装入玻璃毛细管(Cat. 10)。不。: 2-000-050;Drummond Scientific Company Broomall, PA, USA)。毛细管一端用Critoseal粘土密封,置于4 mm (od值)内。EPR石英管。石英管置于谐振腔内,在室温下记录光谱。使用EPR仪器设置如下,微波频率,9.855 GHz;中场,3495g;扫描宽度,100g;微波功率23.77 mW;调制幅度,1g;调制频率,100khz;接收机增益,60db;转换时间14.65 ms,扫描时间30 s;扫描次数,1。EPR数据采集使用Bruker Xepr软件。利用EPR频谱的第一峰(低场)高度产生信号强度。数据处理使用GraphPad Prism 9软件(GraphPad软件,San Diego, CA)。

过氧化氢2O2)测量

根据制造商的说明,使用Amplex™红色过氧化氢/过氧化物酶测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific Waltham, MA)测量全肺匀浆液中的过氧化氢水平。简单地说,组织在- 80°C下粉碎,然后使用添加蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)。然后用辣根过氧化物酶(HRP)和Amplex红染料孵育样品。用Amplex红色荧光染料与样品中的H2O2反应生成红色荧光氧化产物间苯二酚。使用SpectraMax®iD5 (Molecular Devices, CA)读板仪在560nm波长下测定45 min后的吸光度。结果归一化为BCA (bicinchoninic acid)测定试剂盒测量的总蛋白浓度,如前所述[3,57]。

统计分析

使用GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, San Diego, USA)进行统计分析。数据以平均值±平均值的标准误差表示。对于正态分布的数据,我们进行了双向方差分析,然后进行了Tukey事后检验进行统计分析(一天和四天暴露之间的比较)。采用Shapiro-Wilk检验分析数据分布。非正态分布的数据采用双向方差分析和Kruskal-Wallis后验进行评估。我们只对那些只有一个时间点的数据集进行了单因素方差分析(比较只需要检验治疗之间的差异)。p≤0.05认为差异有统计学意义。

利用Emperor[58]对每个Beta多样性指标计算Beta多样性指标(Jaccard距离、Bray-Curtis距离、Unweighted UniFrac距离)和生成的主坐标分析PCoA图。采用QIIME2插件分别采用Kruskal-Wallis检验和perational multivariate analysis of variance (PERMANOVA)计算alpha和beta多样性指数的组间显著性。使用GraphPad [59] (GraphPad Prism version 9)对分类门的相对丰度进行可视化。


目录

摘要
介绍
材料与方法
结果
讨论
结论
数据和材料的可用性
参考文献
致谢

作者信息
道德声明

补充信息



#####

结果

暴露特性与小鼠体重

在暴露期间,通过实时监测CB颗粒和O3水平,证实了稳定的气溶胶生成。暴露期间的重量测量表明达到了所需浓度[CB 1天(10.33±0.80 mg/m3), CB 4天(10.62±0.99 mg/m3), O3 1天(2±0.06 ppm), O3 4天(1.99±0.06 ppm), CB + O3 1天(CB 10.51±0.08 mg/m3, O3 1.77±0.5 ppm), CB + O3 4天(CB 10.97±0.54 mg/m3, O3 1.97±0.26 ppm)]。气溶胶粒径分布表明,CB和CB + O3的中位数直径分别为82.9 nm和84.5 nm,质量中位数直径分别为0.90 nm和0.97 nm,大部分颗粒在纳米尺度范围内。基于电荷的ELPI +测量值的中值直径为64.5 nm和74.4 nm(附加文件1:表S2)。

我们收集了体重数据,表明首次接触后体重略有下降(~ 5%),但没有达到统计学意义(附加文件1:图S1)。此外,反复接触并没有进一步减轻体重。

肺免疫细胞谱

全肺流式细胞术分析暴露动物肺内炎性细胞内流。多次暴露于CB + O3诱导中性粒细胞(EPCAM−,CD45+, Ly6G+)数量显著(p = 0.03)增加(图1B)。多次暴露于CB + O3后,嗜酸性粒细胞(EPCAM−、CD45+、Ly6G−、CD11c−、SiglecF+)数量也有所增加。在多次暴露于炭黑或臭氧后,也观察到肺嗜酸性粒细胞数量增加。单次暴露于CB、O3或CB + O3,以及多次暴露于CB、O3或CB + O3, B淋巴细胞数量增加。单次或多次暴露于O3和CB + O3后,T细胞(Epcam−、CD45+、CD3e+)数量显著下降。用于生成热图的原始值和动物数量见附加文件1:表S3。

吸入暴露后肺部微生物组的特征

从肺样本中共获得1,412,598个特征。然后对序列进行去噪、去复用和嵌合体滤波(占原始序列的25.62%)。序列被划分为otu(相似度为97%)。通过与SILVA 132数据库的比较,将OTUs划分为9门13纲33目58科91属。

肺微生物群落概况

我们评估了暴露是否会改变肺部的微生物群落。在单次暴露后,大多数独特的otu(家庭水平)是由不同的暴露条件共享的(图2A),只有少数是单独暴露所特有的,而没有一个是共同暴露所特有的。在多次共同暴露后,肺部微生物组中独特存在的细菌家族数量增加,而空气、CB和O3中独特存在的细菌家族数量减少(图2B)。这里的“增加”指的是单次和多次接触之间的比较,而家庭数量则指向变化的幅度。表1显示了单次暴露和多次暴露的共同和独特的otu(家族水平),表明细菌群落对环境暴露的反应发生了变化。对照样品经多次CB + O3暴露后,只出现Acetobacteraceae科,Halomonadaceae、Prevotellaceae和Clostridiaceae 1科。我们还分析了基于otu的alpha多样性来计算群落多样性和丰富度。单独接触炭黑或臭氧并没有显著降低香农指数,而与对照和其他个体接触相比,共暴露显示了指数值的显著降低(图2C)。多次暴露于CB和单独暴露于O3可显著降低α多样性(p = 0.02和p = 0.03)。多次暴露于CB + O3也降低了Shannon多样性指数(p = 0.07)。

图2
figure 2

肺部微生物组的改变。A单次暴露后otu的独特变化B多次暴露后共享和独特otu的家族水平分析C Shannon α多样性指数。箱形图显示中位数、四分位数、最小值和最大值。D暴露于CB、O3或CB + O3一天后肺部微生物群的科水平细菌分类特征。E暴露于CB、O3或CB + O3多日后肺部微生物群的科水平细菌分类学特征。F去除前三个家族(单次暴露)后的细菌分类学概况(家族水平)。G去除前三个家族(多次暴露)后的细菌分类学概况(家族水平)。H采用Qiacuity数字PCR对每ng肺DNA细菌载量进行绝对定量分析。1 .多次暴露后肺部绝对细菌负荷与炎症细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、B细胞和T细胞)的相关性。*p≤0.05。*表示与空气相比有显著差异,#表示与单独臭氧和共暴露相比有显著差异。数据以均数±均数标准误差(SEM)表示,并通过双向方差分析和Tukey事后检验进行分析。采用Kruskal-Wallis检验确定Shannon多样性指数n = 3-5的统计学显著性

表1空气后共享和独特的家庭,CB, O3或CB + O3肺部暴露

肺微生物组的组成

在门水平上,变形菌门是肺部最突出的门(超过90%),其次是厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和蓝藻门。单次或多次CB + O3共暴露后,Proteobacteria的水平下降(图2D, E)。我们还分析了细菌组成在科水平上的相对丰度,发现Sphingomonadaceae、Rhizobiaceae、Xanthobacteraceae、Lactobacillaceae和Murribaculaceae是最丰富的科(图2D, E)。通过去除图2F中排名前三的科,可以更好地显示肺部细菌科的分类组成。G.我们发现Caulobacteraceae和Gammaproteobacteria incertae sedis的数量增加,而Pleomorphomonadaceae和Moraxellaceae的数量减少。乳杆菌在吸入CB和O3后呈现减少的趋势(附加文件1:图S3A)。

通过Qiacuity One数字PCR分析的肺部细菌总DNA也显示出与对照组相比的减少(图2H);与任何其他组相比,单次共暴露减少了肺部的总细菌负荷。此外,与对照组相比,多次暴露于CB、O3和CB + O3也减少了细菌总数。在我们的研究结果中,Bray-Curtis和Unweighted Unifrac在肺中没有显示出组间的显著差异(附加文件1:图S3B, C)。我们对炎症细胞数量和绝对细菌/微生物负荷进行了相关性分析。我们发现,CB + O3共暴露诱导的肺部嗜酸性粒细胞增加与细菌总负荷之间存在显著相关性(图2I)。绝对负荷的减少也与B细胞的增加显著相关(图2I)。此外,肺部T细胞数量与总细菌负荷之间存在负相关关系(图2I)。

吸入暴露后肠道微生物群的特征

co的多样性概况朗微生物

在肠道样本中总共获得了2,292,698个特征。然后对序列进行去噪、解复用和嵌合体滤波。通过与SILVA数据库的比较,将序列划分为7门11纲16目32科84属。我们在家族水平上评估了肠道样本中的共享和独特的otu,显示了治疗组之间独特的otu的变化(图3A)。表2列出了对暴露反应的共享和独特的家庭水平otu。为了测量细菌α多样性,我们测量了香农指数。基于计数的香农指数在暴露组之间没有显着变化(图3B)。

图3
figure 3

多次暴露对α多样性指数和肠道微生物群落相对丰度的影响。对多次暴露的共享和独特微生物群的家族水平分析显示,与空气相比,独特的otu发生了变化。B Shannon多样性指数。箱形图显示中位数、四分位数、最小值和最大值。C暴露于CB、O3或CB + O3多日后结肠菌群的科水平细菌分类学特征。D多次暴露后的细菌分类图谱(去除前三科)。E-G结肠内容物中嗜木杆菌、摇摆杆菌和无氧原体显著增加。多次CB + O3共暴露后H乳酸杆菌显著增加。与对照组相比,肠道DNA中的拟杆菌门水平显著增加。肠道内厚壁菌门水平改变。采用Qiacuity数字PCR分析每ng大肠内容DNA的绝对细菌载量。*p≤0.05。*表示与空气相比有显著差异。#表示臭氧和共暴露之间的显著差异。采用Kruskal-Wallis检验确定多样性指数的统计学显著性。n = 5-6

表2空气多次暴露后的共享和独特家庭,CB, O3或CB + O3肠道内容物

暴露对co的影响Lon微生物组组成

肠道菌群中最丰富的细菌门类是变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门。家族水平的微生物群落分析显示,在多次O3和CB + O3暴露中,乳酸杆菌科的相对丰度增加。在所有三个暴露组(CB, O3和CB + O3)中,肠道微生物组中的Ruminococcaceae也有所增加(图3C)。此外,还观察到梭状芽孢杆菌I的水平下降。为了更好地显示分类特征,在图3D中通过去除前三个科来呈现相对丰度。

在属水平上,与对照和单独使用O3相比,CB + O3中的嗜木杆菌、Oscillibacter和无氧原体显著增加(图3E-G)。在暴露于CB + O3的小鼠中,乳酸杆菌显著增加,并且在仅暴露于O3的小鼠中发现了这种趋势(p = 0.13)(图3H)。双歧杆菌的相对丰度在CB单独和CB + O3暴露后也有所增加。我们发现,由于CB + O3在结肠内容菌群中的共同暴露,β多样性指数(Bray-Curits, Jaccard不相似性和Unweighted Unifrac)没有显著差异(附加文件1:图S4A-C)。

肠道细菌负荷

我们观察到,在多次暴露于CB + O3后,暴露组中拟杆菌门和厚壁菌门显著增加(图3I, J)。由于CB和O3共同暴露,厚壁菌门和拟杆菌门的比例没有改变(附加文件1:图S4D)。多次暴露于CB + O3导致肠道绝对细菌负荷显著增加(图3K)。

氧化应激反应

氧化应激是暴露诱导变化的早期媒介,在单次暴露后观察到氧化参数的变化。在肺中,单O3和CB + O3暴露显著增加了Duox2的表达(图4A)。P22在肺中的表达仅在CB + O3共暴露后才增加。Gpx1、Gpx3和Gpx4的表达在共暴露和单独暴露CB和O3后显著增加。然而,与单独暴露O3相比,共暴露诱导Gpx1、Gpx2和Gpx4的表达显著增加。Gpx2仅被共暴露诱导,Gpx3被所有暴露诱导的程度相似。三种暴露均显著诱导Nrf2和Ho-1的表达。然而,与个体暴露相比,CB + O3暴露诱导的Ho-1表达显著增加。mRNA表达的热图统计数据见附加文件1:表S4。Amplex Red测定法对肺组织H2O2的定量也证实,暴露于CB + O3后,氧化产物显著增加(图4B)。通过对灌洗液、血清和肠道组织的EPR分析,进一步证实了共暴露后肺部和全身氧化剂产生增加(图4C-E)。我们观察到肺部细菌总负荷与H2O2水平之间存在显著的负相关(图4F)。同样,在肺总细菌负荷与灌洗和血清氧化剂水平之间观察到负相关(图4G, H)。结肠内容物中绝对细菌负荷与结肠氧化还原电位之间的相关性见附加文件1:图S5。

图4
figure 4

氧化应激反应的改变。A单次空气、CB、O3和CB + O3暴露后肺部Duox2、p22、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Nrf2和Ho-1基因表达的变化。B单次共暴露后肺部H2O2水平显著升高。C单次暴露后支气管肺泡灌洗液CM•自由基室温x波段EPR代表性谱图及信号强度图D单次暴露后血清CM•自由基室温EPR代表性谱图及信号强度图E多次暴露后肠道样品中CM•自由基的代表性室温EPR光谱和EPR信号强度图。F单次暴露后肺部绝对细菌负荷与过氧化氢水平的相关性。G-H单次吸入暴露后肺绝对细菌负荷与灌洗液和血清氧化还原水平的相关性。与18 s相比,基因表达数据显示为对数倍变化(内部控制)。数据以均数±均数标准误差(SEM)表示,并通过单向方差分析(ANOVA)进行分析,然后进行Tukey事后检验。n = 5-6。*p≤0.05。*表示与空气差异显著,#表示与O3在同一时间点差异显著

微生物组改变的系统介质

短链脂肪酸分析

通过GC-MS分析血清SCFAs(醋酸盐、丁酸盐和丙酸盐)表明,暴露于CB + O3(多次暴露)后,乙酸水平显著增加(图5A)。丙酸水平仅在多次接触CB + O3后才升高(图5B)。丁酸水平未因暴露而改变(图5C)。接下来,我们分析了肠道中产生scfa的细菌丰度,并观察到Ruminiclostridium 5, Ruminiclostridium 6, ruminnococcaceae - un培养和lacnospiraceae - un培养的显著增加(图5D-G),它们是醋酸盐和丙酸盐的主要生产者。

图5
figure 5

短链脂肪酸含量和相应微生物组的变化。A多次暴露后血清醋酸盐的改变。多次暴露后血清丙酸和丁酸含量的GC-MS变化。D-G多次暴露CB + O3后,结肠内容物中Ruminiclostridium 5、Ruminiclostridium 6、未培养ruminococcace_un培养和lacnospirace_un培养显著增加。数据以均数±均数标准误差(SEM)表示,并通过单向方差分析(ANOVA)进行分析,然后进行Tukey事后检验。n = 5-6。*p≤0.05。*表示与空气差异显著,#表示与O3在同一时间点差异显著

改变前我的直觉tabolic介质

多次暴露于CB + O3后,基于实时pcr的肠道Gcg(胰高血糖素原)、Glp1r(胰高血糖素样肽1受体)和Cck(胆囊收缩素)mRNA表达显著降低(图6A-C)。Pyy (peptideYY)表达也呈现下调趋势(图6D)。此外,肠道组织中有益菌(乳酸菌)的数量与Glp1r和Cck基因表达呈显著的负相关(图6E、F)。

图6
figure 6

肠道微生物组的改变产生了次级介质。A结肠内多次暴露后Gcg mRNA表达变化为对数褶变化,B-D结肠内多次暴露后Glp1r、Cck和Pyy mRNA表达变化为对数褶变化。E, F结肠多次暴露后Glp1r和Cck mRNA表达与乳杆菌丰度的相关性。数据以均数±均数标准误差(SEM)表示,并通过单向方差分析(ANOVA)进行分析,然后进行Tukey事后检验。n = 5-6。*p≤0.05。*表示与空气有显著差异



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