2023-04-27 13:00

氯喹和羟氯喹通过线粒体途径的心脏毒性

摘要

背景

药物治疗可引起心脏毒性。氯喹(QC)和羟氯喹(HQC)是用于治疗疟疾、皮肤和风湿病的药物。这些药物在2019年被认为有助于治疗冠状病毒病(COVID-19)。尽管QC和HQC成本低且可用,但报告表明这类药物可引起心脏毒性。这一事件的机制尚不清楚,但有证据表明,QC和HQC可通过影响线粒体和溶酶体引起心脏毒性。

方法

因此,我们的研究旨在探讨QC和HQC对心脏线粒体的影响。为了实现这一目标,我们评估了线粒体功能、活性氧(ROS)水平、线粒体膜破坏和心脏线粒体中细胞色素c的释放。采用单、双向方差分析(ANOVA),采用事后Tukey评价线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)活性和细胞色素c释放,采用Bonferroni检验评价ROS水平、线粒体膜电位(MMP)塌陷和线粒体肿胀,确定统计学意义。

结果

基于单因素方差分析(ANOVA),线粒体SDH活性结果显示,CQ的IC50浓度为20µM, HCQ的IC50浓度为50µM。通过双因素方差分析,CQ和HCQ在浓度分别为40µM和100µM时对ROS生成、MMP坍塌和线粒体肿胀的影响最大(p < 0.05)。两种药物在60min的疗效最高(p < 0.05)。统计结果显示,与CQ相比,HCQ在所有浓度下都能引起线粒体细胞色素c的释放(p < 0.05)。

结论

结果表明,QC和HQC可引起心脏毒性,通过氧化应激和心脏线粒体功能障碍导致心脏疾病。

背景

各种药物治疗都可能通过心脏毒性导致心脏病。氯喹和羟氯喹是用于治疗疟疾的药物。此外,这些药物还用于治疗免疫介导的皮肤病和风湿性疾病[1,2,3]。近年来,CQ和HCQ已被用于治疗病毒性疾病,包括冠状病毒病2019 (COVID-19)[4,5]。CQ和HCQ的区别是一个羟基,很难比较。这些药物有能力在细胞和细胞器中积聚,包括溶酶体[1,6]。

有报道表明,CQ和HCQ可通过未知机制引起心脏毒性,包括破坏溶酶体和线粒体等细胞器的功能[7,8]。这些药物被称为促溶体药物,可以在这些细胞器中积累[1,6,9]。CQ和HCQ可通过对线粒体呼吸链和溶酶体芬顿反应的影响提高自由基水平。这一事件与细胞中的氧化应激有关。线粒体呼吸链(MRC)中的复合物I和III参与自由基的产生。此外,这些药物可引起线粒体膜电位(MMP)崩溃,细胞色素c从线粒体向细胞质释放,并通过线粒体途径诱导细胞死亡[5,10,11,12]。

线粒体作为最重要的细胞器之一,在能量产生、活性氧(ROS)产生和细胞死亡中起着重要作用。心脏是人体最重要的活动器官之一。这个器官需要线粒体来执行其正常功能。因此,心脏组织中线粒体数量丰富,需要线粒体作为重要的能量来源。因此,线粒体功能障碍与心脏疾病及其发病机制有关[13,14,15]。ROS水平的增加与线粒体的破坏直接相关,线粒体破坏会导致细胞成分受损。在动物模型中,有报道称,ROS水平的降低与心脏病的减少有关[16,17,18]。由于CQ和HCQ引起心脏毒性的机制尚不清楚,本研究旨在探讨CQ和HCQ对心脏线粒体的心脏毒性机制。

方法

动物

雄性Wistar大鼠(180-220 g)在标准实验室条件下饲养。所有试验方法均按照伊朗德黑兰Shahid Beheshti医科大学动物实验委员会批准的伦理标准和方案进行(伦理代码:IR.SBMU.PHARMACY.REC.1400.158)。

心mitochondria隔离

心肌细胞已被用于线粒体分离。首先采用灌注技术分离心肌细胞[19,20,21]。然后,差速离心从心肌细胞中分离线粒体。接下来,离心过程分为两个阶段:1500 × g, 4℃,10 min; 10000 × g, 4℃,10 min。最终,线粒体悬浮在相应的缓冲液(呼吸、肿胀和MMP缓冲液)[20]中。

琥珀酸脱氢酶估值

采用MTT染色法测定心肌线粒体SDH活性。在37℃条件下,取心脏组织线粒体悬液与CQ(5、10、20、40µM)和HCQ(12.5、25、50、100µM)孵育30 min。接下来,在线粒体悬浮液中加入MTT染料,然后用二甲亚砜(DMSO)溶解MTT染料引起的晶体。最后在570 nm处测定吸光度,CQ的IC50浓度为20µM, HCQ[22]的IC50浓度为50µM。

活性氧水平e估值

采用2′-7′双乙酸二氯荧光素(DCFH-DA)评价心肌线粒体ROS水平。在呼吸实验缓冲液(10 mM Tris、0.32 mM蔗糖、0.5mM MgCl2、50µM EGTA、20 mM Mops、5mM琥珀酸钠和0.1mM KH2PO4)中,用CQ(10、20、40µM)和HCQ(25、50、100µM)孵育心脏线粒体。心肌线粒体经CQ和HCQ孵育后,在线粒体悬液中加入DCFH-DA(10µM)。在孵育后5、30和60分钟,使用分光光度计在Ex: 488 nm和Em: 527 nm[20]波长下评估荧光强度。

Mitochondrial肿胀

为了评估线粒体肿胀,将心脏线粒体悬浮在肿胀实验缓冲液中(230 mM甘露醇、70 mM蔗糖、2 mM三磷酸、3 mM HEPES、1 μ M鱼藤酮和5 mM丁二酸盐),然后用2 CQ(10、20、40µM)和HCQ(25、50、100µM)孵育。在孵育后5、30和60分钟,使用ELISA读取器在540 nm处检测吸光度。样品吸光度降低与线粒体肿胀[20]有直接关系。

MMP崩溃e估值

用罗丹明123 (Rh 123)评价心脏线粒体的MMP。在MMP实验缓冲液(10 mM KCl、68 mM d -甘露醇、220 mM蔗糖、5 mM KH2PO4、50 μ M EGTA、2 mM MgCl2、5 mM琥珀酸钠、2 mM鱼藤酮和10 mM HEPES)中,用CQ(10、20、40µM)和HCQ(25、50、100µM)孵育心脏线粒体。心肌线粒体与CQ和HCQ孵育后,在线粒体悬液中加入Rh 123(10µM)。在孵育后5、30和60分钟,使用分光光度计在Ex: 490 nm和Em: 535 nm[23]波长下评估荧光强度。

细胞色素c释放e估值

CQ(10、20、40µM)和HCQ(25、50、100µM)对细胞色素c释放的影响采用Quantikine人/大鼠/小鼠细胞色素c免疫测定试剂盒(R&D Systems Quantikine ELISA kit, Minneapolis, MN, USA)。

统计分析

使用GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA)对结果进行分析。P < 0.05认为差异有统计学意义。


目录

摘要
背景
方法
结果
讨论
结论
数据可用性
参考文献
致谢

作者信息
道德声明




#####

结果

CQ/HCQ和SDH活性

基于一项初步研究,通过SDH活性评估CQ(5、10、20和40µM)和HCQ(12.5、25、50和100µM)对线粒体功能的影响。报告显示,除最低浓度(p < 0.05)外,CQ(图1A)和HCQ(图1B)在所有浓度下都能降低SDH的活性(p < 0.001)。这一事件与线粒体功能下降有关(图1A-B)。单因素方差分析结果显示,CQ浓度为40µM, 60 min (p < 0.001)和HCQ浓度为100µM, 60 min (p < 0.001)对SDH活性的降低效果最大。CQ和HCQ的IC50浓度分别为20µM和50µM。

图1
figure 1

SDH活性测定。氯喹(A)和羟氯喹(B)对心脏线粒体SDH活性的影响。数据以mean±SD (n = 3)表示。***与对照组比较,差异有统计学意义(P < 0.001)

CQ/HCQ和ROS水平

基于MTT试验和IC50浓度,以CQ浓度为10、20、40µM, HCQ浓度为25、50、100µM评价心脏组织线粒体中ROS水平等指标。结果表明,CQ(图2A)和HCQ(图2B)呈浓度依赖模式,在所有暴露时间(5,30和60分钟)都能够增加心脏线粒体中的ROS水平(p < 0.0001)。统计报告显示,这两种化合物在最高浓度和最高时间均能显著(p < 0.0001)提高离体线粒体的ROS水平。

图2
figure 2

ROS形成试验。氯喹(A)和羟氯喹(B)对心脏线粒体ROS水平的影响。数据以mean±SD (n = 3)表示。**** (P < 0.0001)与对照组比较差异有统计学意义

CQ/HCQ和MMP崩溃

ROS水平的增加可能与线粒体膜的破坏和MMP崩溃的后果有关。据此,评价CQ和HCQ对心肌线粒体MMP塌陷的影响。结果表明,最低浓度的CQ能提高心肌线粒体ROS水平(60 min) (p < 0.001)。然而,在cqf浓度为20和40µM时,该事件在所有暴露时间都发生(图3A) (p < 0.0001)。同时,在使用的所有浓度和暴露时间下,HCQ都增加了心脏线粒体中的ROS水平(图3B) (p < 0.001和p < 0.0001)。结果表明,这两种化合物都能引起MMP以浓度和时间依赖的模式崩溃。

图3
figure 3

线粒体膜电位测定。氯喹(A)和羟氯喹(B)对心肌线粒体MMP塌陷的影响。数据以mean±SD (n = 3)表示。*** (P < 0.001)和**** (P < 0.0001)与对照组比较差异有统计学意义

CQ/HCQ和mitochondrial肿胀

线粒体肿胀是ROS产生的另一个后果。结果表明,CQ(图4A)和HCQ(图4B)呈浓度依赖模式,在所有暴露时间(5、30和60分钟)都能增加心脏线粒体的线粒体肿胀(p < 0.0001)。线粒体肿胀率在最高浓度和最高时间发生。

图4
figure 4

线粒体肿胀测定。氯喹(A)和羟氯喹(B)对心脏线粒体肿胀的影响。数据以mean±SD (n = 3)表示。**** (P < 0.0001)与对照组比较差异有统计学意义

CQ/HCQ和细胞色素c释放

结果表明,CQ浓度为20 (p < 0.01)和40µM (p < 0.001), HCQ浓度为25 (p < 0.05)、50 (p < 0.001)和100µM (p < 0.001)均能引起心肌线粒体细胞色素c的释放。统计结果显示,与CQ相比,HCQ在所有施加浓度下都能使线粒体释放细胞色素c (p < 0.05),而在CQ最低浓度时没有这种作用(p < 0.05)。环孢素A (Cs.A)作为线粒体通透性过渡孔(mPTP)抑制剂和丁基羟基甲苯(BHT)作为抗氧化剂能够阻止CQ(20µM) (p < 0.01和p < 0.05)和HCQ(50µM) (p < 0.01)在心脏线粒体中引起的细胞色素c的释放(图5 - b)。

图5
figure 5

细胞色素c释放试验。氯喹(A)和羟氯喹(B)对心肌线粒体细胞色素c释放的影响。数据以mean±SD (n = 3)表示。* (P < 0.05)、** (P < 0.01)、*** (P < 0.001)与对照组比较差异有统计学意义。##与氯喹(20µM)组和羟氯喹(50µM)组比较,差异有统计学意义(P < 0.01)

讨论

心脏病是公共卫生领域的主要问题之一。为了探讨暴露于CQ和HCQ引起心脏毒性的机制,我们评估了线粒体功能、ROS水平、线粒体膜破坏和细胞色素c释放等参数。研究表明,QC和HQC可引起线粒体功能障碍[5,11]。对于COVID-19的治疗,研究表明,HCQ和类似化合物具有在线粒体中积累的能力,并可以通过破坏电化学质子梯度[25]来抑制线粒体ATP的产生。因此,HCQ可以破坏需要ATP才能正常活动的组织。另一项研究结果表明,HCQ可导致线粒体异常[26]。

线粒体被认为是ROS产生的主要细胞内来源。活性氧的产生、线粒体含量的降低、呼吸链复合体活性的降低以及线粒体形态的改变是线粒体功能障碍[27]的最重要特征。在心肌细胞中,线粒体的数量对于正常功能来说是很高的。此外,心脏的代谢是有氧的,线粒体提供心肌细胞所需的90%的能量(ATP)[28,29]。

最初,结果表明QC和HQC降低了心脏线粒体的线粒体功能/线粒体复合体II。复合体II在ROS的产生中起作用。ROS在调节细胞中重要的信号通路中发挥作用,其中一些具有心脏保护作用[28]。在心脏中,MRC中的复合物I、II和III是ROS产生的来源。心脏组织中抗氧化酶的水平很低,因此,它对高水平的自由基(ROS)很敏感。因此,高水平的ROS和由此产生的氧化应激可导致多种心脏并发症[30,31]。

Chaanine等人的研究表明,大剂量QC可通过线粒体和溶酶体功能障碍引起压力过载肥厚大鼠模型的心脏毒性。在这项研究中,已经证明QC会破坏线粒体的抗氧化能力并增加氧化应激(ROS生成)[32]。因此,QC可以为氧化应激提供条件。氧化应激是一种破坏性的状态,可以在多种疾病的病理生理中发挥作用[33,34]。结果表明,QC和HQC均能提高心脏线粒体中ROS的水平。该事件与氧化应激有关,氧化应激可引发线粒体变化,从而导致线粒体功能障碍[35,36]。既往研究表明,QC和HQC可使ROS水平升高,引起氧化应激[5,12]。

本研究观察到QC和HQC对心脏线粒体MMP塌陷和线粒体肿胀的影响。这两种情况都会破坏线粒体结构。此外,ROS可能是这两个事件的来源。在心脏缺陷中,线粒体肿胀,线粒体基质密度降低。在线粒体中,MMP在能量(ATP)的产生中起着驱动作用。此外,它还参与细胞死亡的诱导。因此,MMP崩溃与不可挽回的后果有关。我们的结果与过去的研究一致,表明QC导致MMP崩溃[6,11,12]。细胞色素c的释放是MMP崩溃的后果之一。在细胞凋亡信号传导中,线粒体释放细胞色素c被认为是早期事件之一[39,40]。我们的结果表明,QC和HQC导致心脏线粒体中细胞色素c的释放。这一结果与之前的研究一致,即QC导致线粒体bb0释放细胞色素c。由于心肌细胞对线粒体的依赖性,线粒体功能障碍与心脏疾病有关[41,42]。

结论

综上所述,QC和HQC通过影响线粒体呼吸链复合物提高ROS水平和氧化应激水平。此外,通过QC和HQC, ROS水平升高,导致MMP塌陷和线粒体肿胀。这些事件与心脏线粒体细胞色素c的释放有关。随后,QC和HQC可通过启动心肌细胞线粒体凋亡信号导致心脏疾病。



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