2023-04-27 13:00

使用速效固体溴氰菊酯克服按蚊对杀虫剂的抗药性

摘要

背景

使用拟除虫菊酯杀虫剂控制传播疟疾的按蚊正变得越来越具有挑战性,因为病媒种群中存在广泛的耐药性。然而,开发新的杀虫剂和杀虫配方既耗时又昂贵。一种更有效的溴氰菊酯结晶形式是通过加热商业结晶形式制备的,以前有报道称,对易感的北美四角按蚊的作用速度要快12倍。本文研究了白垩分散热活化溴氰菊酯在西非五种按蚊中克服各种抗性机制的潜力,并评估了其长期持续致死性。

方法

更活跃的溴氰菊酯形式是在含有溴氰菊酯的商业粉尘中通过加热购买的材料产生的。与市售溴氰菊酯粉尘相比,进行了跗关节接触生物测定,以调查其对耐药按蚊种群的功效、效力和作用速度。

结果

在所有情况下,D-Fense粉尘加热产生更活跃形式的溴氰菊酯比市售配方有效得多。100%的Banfora M和Kisumu种群在接触后10分钟被击倒,此后没有恢复。gaua -ara和Tiefora菌株在15分钟内100%被敲除,VK7 2014菌株在20分钟内100%被敲除。所有病例暴露后24 h死亡率均为100%。相反,商业配方(未加热)对VK7 2014、Banfora和Gaoua-ara种群的24小时死亡率低于4%,对Tiefora和Kisumu种群的24小时死亡率分别为14%和47%。热活化粉尘在加热13个月后保持相当的功效。

结论

热活化形式的商用溴氰菊酯d-防御粉尘比购买的材料性能更好,显著提高了对所有测试的拟除虫菊酯抗性菌株的功效。这种增加的致死率在实验室环境条件下保存了13个月。可采用高能形式的常用杀虫剂,通过更快地从各自的固体表面吸收杀虫剂分子,克服非洲按蚊的各种抗性机制。也就是说,可以在不改变杀虫剂分子组成的情况下,用一种它们具有抗药性的杀虫剂杀死具有抗药性的蚊子。

背景

迄今为止,拟除虫菊酯是杀虫剂处理过的蚊帐(ITNs)上可用的唯一一类杀虫剂,对它的抗药性在疟疾病媒按蚊中广泛存在。抗药性大大降低了拟除虫菊酯的功效,并威胁到21世纪在疟疾控制方面取得的实质性进展[1,2]。尽管存在地理隔离,但拟除虫菊酯的广泛使用在众多人口中造成了不同程度的抗性和不同的抗性机制。溴氰菊酯(DM, (S)-氰基(3-phenoxyphenyl)甲基(1R,3R)-3-(2,2-二溴乙烯基)-2,2-二甲基环丙烷-1-羧酸酯;图1),一种合成拟除虫菊酯杀虫剂,是室内残留喷洒(IRS)的最重要活性成分,为数百万人提供疟疾控制[1,3]。在世界卫生组织(世卫组织)列入资格预审的病媒控制产品[4]中,三苯二酚是五种IRS制剂、十种ITNs和两种空间喷雾剂中的一种活性成分。DM广泛用于控制疟疾媒介按蚊和虫媒病毒媒介伊蚊。

图1
figure 1

A DM. B粉末的x射线衍射数据来自表格I(蓝色)和表格II(橙色)。(C) I和(D) II型单晶结构在100k下测定。图改编自Yang等人

接触性杀虫剂,如拟除虫菊酯,通常是结晶的。该研究的作者最近的报告表明,接触型杀虫剂的杀虫活性取决于其固体形态的晶体结构和相关自由能[5,6,7,8,9],也称为多晶型。在环境条件下,通常可以获得不同的晶体形式。包括DM在内的杀虫剂的致命性取决于昆虫在接触晶体表面时对其的吸收,然后将杀虫剂的分子形式迁移到目标部位。对杀虫剂的抗性可能与不同的机制有关,包括靶位点的突变或参与代谢的细胞色素P450酶的上调[10,11]。有理由认为,增加的杀虫剂吸收率可以压倒代谢抗性机制。

晶体接触杀虫剂的致死率与其晶体结构之间的关系最终出现在热化学中。弱分子间相互作用和相关的浅势能超表面很容易导致固态下具有不同分子组织的固体晶体形式(多晶),伴随着不同的化学和物理性质,包括晶体自由能。首先在滴滴涕和林丹等历史上相关的化合物中报道了多晶型的致死率与热力学稳定性之间的负相关关系,但在当代杀虫剂中也报道了新发现的多晶型的双胍和吡虫啉,它们是当今最广泛使用的杀虫剂之一。除了先前报道的两种形式[6]外,还发现了7种新的吡虫啉多态性。这些多晶型的不同之处在于分子在其晶格中的排列和它们在不同晶体表面的表现。值得注意的是,最不稳定的吡虫啉多聚体对易感按蚊和伊蚊的活性分别是热稳定的市售吡虫啉多聚体的6倍和9倍。重要的是,这些亚稳态多晶被发现在至少6个月的时间内不会转化为热力学稳定的形式,符合世卫组织在该领域实际使用的指南[6,12]。第二种DM晶型(图1)[5],在确定其晶体结构后表示为形式II,通过冷却其熔体生成。II型晶体对黑腹果蝇的活性是I型晶体的近7倍,黑腹果蝇是一种被接受的载体[13]的代理。值得注意的是,含有DM (d -防御粉尘)的商用粉尘配方;0.05 wt% DM)加热到DM熔点以上,然后冷却到环境温度,对易感的埃及伊蚊和四角按蚊的作用分别比原始DM粉尘快9倍和12倍。这种增加的致死率与观察到的纯形式II对果蝇的致死率相似,与灰尘中更活跃的形式一致。此外,这种持续至少3个月的高致死率表明,一种更活跃的亚稳态形式可以在动力学上稳定地转化为一种不太活跃的热力学稳定形式[5]。虽然溴氰菊酯的分子结构(图1A)不受这一简单操作的影响,但从粉末x射线(图1B)和单晶衍射(图1C、D)推断,两种形式的分子在晶格中的具体排列是不同的。近年来,新的杀虫剂、驱蚊剂和抗疟疾化合物被引入。但是,在该领域引入新的化学制剂需要大量的劳动力和资本投资[14,15,16,17]。因此,通过操纵现有化合物的晶体结构来制造更活跃的固体形式的工程可以更快、更便宜、风险更小,因为可以避免新的物质组成。

本研究通过实验验证了热激活DM粉尘对耐药的coluzzii按蚊Banfora M、VK7 2014和Tiefora以及阿拉伯按蚊Gaoua-ara[19]均有较好的抑制效果。冈比亚按蚊是一种蚊子的复合体,其中三种与布基纳法索的拟除虫菊酯类杀虫剂高耐药性有关,包括安。冈比亚严格感蚊(s.s.)、科鲁兹按蚊和安。arabiensis[18]。这些结果表明,由于接触性杀虫剂的快速吸收,高能固体形式的接触性杀虫剂可以压倒某些抗性机制,这提示了在高抗性蚊子种群中解决媒介控制问题的途径。

方法

睑板化验

从pestcontrolpro购买的D-Fense粉尘主要由碳酸钙载体组成,其上分散了0.05%重量的溴氰菊酯(DM)。在玻璃小瓶中加热至150℃30分钟激活粉尘,然后冷却到环境温度。将0.05 g热活化d - fence粉尘分散到100 mm的跗平板上,同时以相同的方式将未加热的d - fence粉尘分散到相同数量的平板上,从而制备跗平板试验。然后将10只蚊子放入每个盘子中。蚊子暴露30分钟,在此期间,击倒(KD),平均在三次试验中,每隔5分钟进行评分。暴露后60分钟进行敲除评分,24小时进行死亡率评分。不含d - fence粉尘的对照板也进行了比较测试。每个跗骨板上的灰尘量对应于根据灰尘中0.05%的DM负荷估计的DM剂量约为80 mg/m2。通过对纯溴氰菊酯的热重分析确定,在500-550°C加热30分钟后,溴氰菊酯会被分解,用跗平板法测定d -防御载体粉尘的活性。d - fence粉尘在500-550°C加热时,通过质谱(三重四极杆质谱)检测,在噪声以上没有DM痕迹;有机物被热解。

蚊子饲养

安的基苏木菌株。冈比亚在1975年成为肯尼亚的殖民地。利物浦热带医学院(LSTM)持有的菌株来自疟疾研究和参考试剂资源中心(http://k1.fpubli.cc/file/upload/202304/23/up2aix0ayse)。2015年,从利物浦热带医学院(LSTM)和国家Paludisme研究与形成中心(CNRFP)收集的幼虫中定殖了来自布基纳法索胡埃省(Valley de Kou 7)的VK7 2014菌株和来自布基纳法索班弗拉区(Banfora)的como 省(Banfora M)菌株。2018年,LSTM和CNRFP从收集的幼虫中定植了来自布基纳法索班福拉区como 省的Tiefora菌株。来自布基纳法索高瓦区Poni省的Gaoua-ara菌株是2018年从圣 科学研究所(IRSS)收集的幼虫中定殖的。

所有耐药菌株(除Kisumu外)均通过接触0.05%溴氰菊酯进行世卫组织柱状生物测定,每3至5代常规筛选一次,以维持其耐药表型,并每年对所有菌株进行不同作用模式类别[19]的8种杀虫剂(VK7 2014除外,对6种杀虫剂进行了分析)的抗性分析。Gaoua-ara、Banfora M、Tiefora和VK7 2014显示对拟除虫菊酯类杀虫剂和滴滴涕具有抗性,Gaoua-ara和Tiefora也对敌敌畏、残杀威和灭虫威具有抗性,而Banfora M对灭虫威具有抗性。在所有耐药菌株中显著的PBO协同作用表明代谢抗性的参与。目标位点突变以不同的组合和频率存在于抗性菌株中,并且与杀虫剂抗性相关的其他基因也存在上调。在26±2℃,70%相对湿度±10%的标准条件下,L12:D12 h明暗光周期下饲养。幼虫饲喂磨碎鱼粉(TetraMin®热带鱼片,Tetra®,Blacksburg, VA, USA),成虫随意饲喂10%蔗糖溶液。


目录

摘要
背景
方法
结果
讨论
结论
数据和材料的可用性
缩写
参考文献
致谢

作者信息
道德声明




#####

结果

与热激活粉尘相比,商用溴氰菊酯d -栅栏粉尘对抗性菌株的无效效果很明显(图2B-F)。通过将5株耐药按蚊暴露于所获得的商业d - fence粉尘和热激活制剂,收集了跗关节试验数据。没有d - fence粉尘的对照板显示,在伴随测量的统计误差范围内,蚊子死亡的数量可以忽略不计。在加热至500 ~ 550℃的DM粉尘中,混合在白垩质载体中的DM晶在加热后被TQD(三重四极杆质谱)完全分解,没有DM母离子(505.9 m/z)。加热后的粉尘不致命(图2,插图C),证实了溴氰菊酯是导致昆虫死亡的主要原因。

图2
figure 2

本研究中使用的蚊子的种类、品系和来源。B-F WHO碱基测定。拟除虫菊酯耐药按蚊B Tiefora株,C VK72014, Inset C. WHO标准测定。拟除虫菊酯抗性按蚊VK7 2014株暴露于500 ~ 550℃的商用D-Fense粉尘中的平均击倒率和24 h死亡率。D Banfora M, E Gaoua-ara F Kisumu按蚊暴露于加热D- defense粉尘(150°C, 30 min)。误差条对应于基于三次重复测量的一个标准偏差

市售d - fence Dust在第一次敲除观察20分钟前对Tiefora蚊子无效(图2B),约7%的蚊子被敲除。在30min时观察到敲除的峰值(21%),但在24h后总死亡率较低(14%)。在其他测试菌株中也观察到类似的趋势。VK7 2014的初始敲除率(图2C)在15分钟为3%,在25分钟达到20%的峰值,但24小时后死亡率仅为3%。Banfora蚊子的初始敲除率(图2D)在25分钟观察到,其中记录的峰值敲除率为16%。24 h后,班福拉蚊死亡率仅为3%。Gaoua-ara蚊(图2E)种群中首次观察到的灭活率为20 min灭活3%,30 min灭活峰值为10%,但24 h后死亡率仅为3%。Kisumu蚊(图2F)受该商品的影响最大。第一次基因敲除发生在25分钟(14%),60分钟出现基因敲除高峰(79%)。24小时后死亡率为47%。

热激活d - fence粉尘暴露24 h后,所有5个菌株的死亡率均为100%。在Tiefora种群中,暴露5分钟后首次观察到基因敲除(图2B), 15分钟内基因敲除100%,24小时内死亡率100%。同样,VK7 2014(图2C)在5分钟内基因敲除9%,20分钟内基因敲除100%,24小时内死亡率100%。值得注意的是,在VK7种群中,100%基因敲除的时间比其他测试种群晚。Banfora和Kisumu(图2D和F)菌株在5分钟内分别表现出23%和7%的敲除。10 min杀灭100%,24 h杀灭100%,5 min杀灭10%(图2E), 15 min杀灭100%(图2E), 24 h杀灭100%,与其他菌株相似。

用VK7 2014和高瓜阿拉安作为对照,对热活性粉尘贮存6个月后的致死率进行了测试。coluzzi和An。然后在13个月时再次针对VK7 2014和Tiefora An。coluzzi法评价贮藏后的持续致死率(图3A-D)。对于VK7 2014和Gaoua-ara,使用获得的d - fence Dust几乎无效,在这两种情况下仅在30分钟(3%)出现敲除,24小时后死亡率为0%。相反,热激活的d - fence Dust在6个月后保持其致死率。两株毒株均在5 min后出现第一次敲除,gaua -ara为19%,VK7 2014为13%。24 h后,VK7 2014和Gaoua-ara的死亡率分别为76%和92%。值得注意的是,与其他菌株相比,VK7 2014菌株受热激活粉尘的影响略小,超过20%的被击倒的蚊子在接触24小时后恢复。13个月后,热激活D- fence粉尘保持其致死性(图3C和D), 5 min后观察到第一次敲除,VK7种群14%,Tiefora种群50%。24小时后,观察到VK7 2014和Tiefora在两种情况下的死亡率均为100%。这些数据表明,通过加热产生的更致命的溴氰菊酯固体形式在至少13个月内是稳定的,不会转变为热力学稳定且活性较低的形式,符合世卫组织在实地实际使用的指导方针。这一观察结果应鼓励使用亚稳态形式的接触性杀虫剂来控制疟疾病媒。

图3
figure 3

世卫组织盐试验。[A]、[B]、[C]、[D]、[j]、[j]、[j]、[j]、[j]、[j]、[j]、[j]

讨论

图3B-F和a - d中详细描述的实验,代替了直接监测分子从晶体到靶点的路径,提供了与蚊子种群对固体形态的不同摄取率相关的动力学,以及这如何决定接触性杀虫剂的总体功效。对于所有菌株,热激活的d - fence Dust比商业形式的作用更快,最终也比24小时死亡率高得多。这表明,吸收率,虽然经常被忽视,是一个更大的动态的重要组成部分。

与观察到的其他菌株相比,热激活粉尘和商业粉尘对VK7 2014蚊子的早期暴露效果差异不那么明显。然而,24小时后,实质性差异是明显的;不到5%的人被未加热的灰尘杀死,而100%的人被热激活的灰尘杀死。VK7 2014与其他毒株的区别在于达到100%击倒所需的时间较长。VK7 2014在20 min内达到100%杀灭,其余菌株均在10 ~ 15 min内达到100%杀灭。当暴露于6个月前加热的粉尘时,高瓜阿拉地区被杀灭的蚊子在24 h内有部分恢复(8%),但VK7 2014的比例更高(24%)。这再次表明对这种菌株的功效略低。自然,不同的抗性机制对杀虫剂的解毒和/或无效作用是不同的,这一点在对VK7 2014抗性蚊子进行的实验中得到了揭示(图2C和3A)。每种抗性菌株所表达的抗性机制组合是不同的,很难确定每种抗性的相对贡献或解释这种差异。VK7 2014的995 F等位基因是固定的,而该SNP在其他测试菌株中以低频率存在,这可能起作用,也可能是表皮碳氢化合物水平升高[19,20]。13个月后,24小时未观察到被击倒的蚊子恢复,可能是由于种群之间的抗性程度略有差异。

除了靶位和代谢耐药机制外,本文测试的拟除虫菊酯类杀虫剂强烈耐药菌株中还存在可能直接影响杀虫剂吸收和渗透的机制。经观察,表皮增厚可减少杀虫剂的渗透,并有助于产生拟除虫菊酯抗性[21,22,23]。化学感觉蛋白SAP2在蚊子的腿和触须中表达,并且过度表达与另一种抗性菌株的拟除虫菊酯抗性有关。产自布吉纳法索的冈比亚sensus latto (s.l.)。与表皮烃(CHC)合成途径相关的基因在Banfora M、Bakaridjan和Gaoua-ara菌株中表达上调,而在Tiefora和VK7 2014中表达下调,似乎表皮抗性在Gaoua-ara[19]中尤为显著。

这项研究使用了一种市售的粉尘产品,用于控制家庭害虫,它戏剧性地展示了通过操纵结晶杀虫剂的特性来克服拟除虫菊酯抗性机制的潜力。可用于公共卫生的杀虫剂数量非常有限,新化合物的发现和开发既缓慢又昂贵。由于工具箱中的工具如此之少,因此不能过早地丢弃它们。这些结果表明,有可能生产出更有效的拟除虫菊酯类杀虫剂,以克服现有的抗性机制,从而恢复和保留这类历史上重要的杀虫剂的有效性。随着新杀虫剂的开发,明智地使用每一种杀虫剂以减缓抗药性的发展速度是至关重要的。为了更好地了解结晶杀虫剂是如何在其他相关条件下,例如在ITN的纤维上或IRS配方中,呈现给疾病的蚊子媒介的,有必要进行进一步的调查。通过在产品开发阶段和整个产品生命周期中发现物理表现变化的影响,并在给定的基质上确定每种杀虫剂的最有效形式,有可能减少产品有效所需的杀虫剂量。这对于可能比拟除虫菊酯贵得多的新化合物来说尤其重要。重要的是要重新考虑现有的逻辑,即一种产品杀死蚊子的效果仅仅取决于所含杀虫剂的浓度,而不是考虑其物理性质和外观,以便在较低浓度下实现更大的杀死效果。

结论

本研究结果清楚地表明,亚稳态溴氰菊酯能有效克服拟除虫菊酯抗性蚊子种群的某些抗性机制或机制。与所有被测试的耐药菌株相比,热激活粉尘的性能要优越得多。热激活的d - fence粉尘在暴露后24小时杀死了100%的菌株,而从商业形式观察到的最高死亡率约为14%。热激活粉尘对VK7 2014蚊子的作用最慢,但死亡率仍然很高,这表明在一系列耐药菌株中都看到了增强的效果,进而看到了机制和机制的组合。热活化粉尘在加热13个月后保持相当的功效。此前,有报道称发现了一种更快的溴氰菊酯形式,与商业形式bbb相比,它对按蚊和伊蚊的杀伤力更高。现在,同样的更快的形式也被证明对拟除虫菊酯抗性菌株的作用更快、更致命,从而突出了固态化学在对抗蚊子种群杀虫剂抗性方面必须发挥的关键作用。很少有不同作用类型的杀虫剂可用于防治病媒蚊子;直到最近才在蚊帐中使用拟除虫菊酯。虽然含有拟除虫菊酯和氯虫腈、吡丙醚或增效剂胡椒酰丁醇(PBO)的驱虫蚊帐现在已经有了,但开发新的甚至是重新用途的杀虫剂的管道很长,而且非常昂贵。将DM或其他拟除虫菊酯配制成一种能够克服耐药性的形式,可以在更短的时间内提供一种有效的新工具。大多数已知和新型杀虫剂都是结晶性的,了解它们的结晶结构如何影响生物活性对于开发最佳病媒控制产品至关重要。更多地了解杀虫剂的结晶行为和晶体工程知识的应用可以帮助克服抗药性。它还可以降低病媒控制产品的成本,允许在最有效的物理状态下使用更少量的化合物,以获得更大的效果。



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