2023-04-27 12:30

阻断CCR4通过调节调节途径打破慢性乙型肝炎患者的免疫耐受

摘要

背景

包括检查点抑制剂和toll样受体8激动剂在内的免疫靶点最近引起了人们对慢性乙型肝炎(CHB)患者乙型肝炎病毒(HBV)特异性T细胞衰竭的关注。趋化因子受体在病毒感染中也有类似的重要作用;然而,它们在慢性乙型肝炎中的作用仍然知之甚少。因此,在本研究中,我们评估了趋化因子受体4 (CCR4)在慢性乙型肝炎患者免疫抑制中的作用。

方法

我们在CHB中鉴定了CCR4+CD8+ T细胞,并确定了它们参与免疫抑制。此外,我们研究了mogamulizumab抗体阻断CCR4是否可以恢复hbsag特异性T细胞的功能衰竭。

结果

CHB患者表现出更高的CCR4+CD8+ T细胞频率,随着HBsAg水平和纤维化评分的升高而增加。在体外,HBs抗原触发CCR4表达。这些细胞表达多种抑制受体,并通过产生过量的免疫调节细胞因子IL-4、IL-5、IL-10和TGF-β1表现出免疫抑制功能。CCR4阻断显著提高hbsag特异性抗病毒细胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL-21)在T细胞中的增殖能力,使CD4细胞向辅助性T细胞1(Th1)和辅助性T滤泡细胞(TFH)极化,CD8细胞向细胞毒性T细胞1(TC1)和细胞毒性T滤泡细胞(TCF)极化。抗ccr4治疗后,细胞毒性电位提高,免疫抑制细胞因子未被诱导,从而消除了治疗性免疫抑制的风险。CCR4阻断通过控制Tregs的扩增和TGF-β1的产生抑制Tregs诱导的免疫耐受,从而抑制Tregs的发育和效应功能。

结论

CCR4阻断在T细胞中重建抗病毒免疫应答,限制treg的免疫抑制功能,代表treg是一个有希望的功能治愈慢性乙型肝炎的免疫治疗靶点。

背景

慢性乙型肝炎(CHB)感染的有效治疗主要依赖于核苷类似物,它能有效地抑制病毒复制并改善肝脏炎症,但不能有效地从肝脏中清除病毒[1,2,3,4,5,6]。此外,慢性乙型肝炎感染患者通常需要长期治疗,这与耐药、不良反应、不依从性和高成本相关。此外,停止治疗会增加乙型肝炎病毒(HBV)再激活的风险。因此,迫切需要新的治疗策略,以在短时间内实现功能性治愈,避免长期使用抗病毒治疗相关的并发症。

乙肝清除的主要障碍之一是慢性乙型肝炎患者有缺陷的适应性免疫反应。这些患者表现出功能失调的hbv特异性T细胞反应,这主要归因于共抑制分子的富集、抗病毒细胞因子和细胞毒性功能的减少以及T调节细胞(Tregs)的扩增,这与病毒的持续存在和疾病进一步进展为纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)有关[9,10]。受损的hbv特异性T细胞反应也通过限制B细胞分泌中和抗体从而阻止病毒消除而影响体液免疫。一些研究和临床试验正在研究免疫治疗方法,通过检查点阻断抑制途径(如程序性死亡-1 (PD-1))或使用toll样受体8 (TLR8)激动剂来增强抗病毒免疫反应。一项临床试验研究了PD-1检查点阻断对使用PD-1抑制剂nivolumab的病毒抑制性乙型肝炎e抗原(HBeAg)阴性CHB患者的影响,并报告了大多数患者血液中HBsAg特异性T细胞的显著增加和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)水平的适度下降。当PD-1阻断与B细胞成熟细胞因子如IL-2和IL-21联合使用时,可以部分恢复功能失调的病毒特异性B细胞,这表明PD-1是恢复适应性免疫应答的关键靶点。最近,由于TLR8能够通过刺激促炎和免疫调节细胞因子诱导宿主免疫,使用激动剂激活TLR8正受到越来越多的关注。TLR8激动剂,特别是GS-9688 (selgantolmod)可诱导外周血单个核细胞产生细胞因子,并启动几种免疫细胞的效应功能,这突出了免疫治疗靶点控制CHB感染的潜力[12,13]。虽然目前的研究主要集中在抑制受体和tlr作为慢性乙型肝炎患者的治疗选择,但趋化因子受体(ccr)的作用被忽视了。

趋化因子受体超家族的主要功能是介导细胞迁移和归巢到感染和损伤部位。然而,新出现的数据表明,这些受体具有几个关键的调节功能[14,15]。ccr是存在于各种免疫细胞表面的细胞因子/趋化因子受体,可与不同的细胞因子和趋化因子相互作用。单个CCR可以与单个或多个配体相互作用。我们之前的数据表明,包括CXCR1和CXCR2在内的CCRs在hbv相关的急慢性肝衰竭患者中诱导炎症和肝细胞死亡,并且SCH 527,123拮抗剂阻断这些受体可通过限制促炎细胞因子和活性氧(ROS)的产生显著抑制细胞死亡和炎症,这表明CCRs在肝脏疾病中的潜在作用bbb。趋化因子受体4 (CCR4)在循环和组织驻留T细胞上表达。在各种T细胞亚群中,CCR4主要由T辅助2型(Th2)和T调节细胞(Tregs)表达。CCR4与CCL17和CCL22相互作用,在炎症条件下执行包括免疫细胞运输在内的各种功能,并且当其配体适当触发时可能具有深远的调节作用。CCR4在不同类型的癌症中的作用正在被广泛研究,包括HCC,它诱导细胞迁移,促进肿瘤生长和转移。不仅CCR4,其配体CCL17和CCL22在人和小鼠肝癌中也被发现高度过表达。在HCC过程中,恶性细胞产生CCL22并募集CCR4+ Tregs,促进恶性细胞[19]的免疫逃逸。由于CCR4主要在负责免疫抑制微环境的Th2细胞和treg细胞上表达,抗CCR4抗体如mogamulizumab正被用于增强抗癌免疫[20]。考虑到CCR4在HCC中的潜在临床应用,CCR4作为一种潜在的治疗靶点近年来受到越来越多的关注。然而,CCR4表达是否在HCC过程中直接上调并参与病情恶化,或者在早期疾病如慢性HBV感染中发挥作用尚不清楚。因此,在本研究中,我们研究了CCR4在慢性HBV感染患者中的作用,并试图了解CCR4是否参与抑制HBV特异性T细胞反应。此外,我们确定了阻断CCR4是否可以逆转hbv特异性T细胞的免疫抑制,这是清除病毒所必需的。在这里,我们证实CCR4+ CD8+ T细胞在慢性乙型肝炎感染期间通过产生免疫调节细胞因子和限制抗病毒细胞因子的产生来维持免疫抑制环境。mogamulizumab(抗CCR4抗体)单克隆抗体阻断CCR4可显著改善CD4+和CD8+ T细胞产生的抗病毒细胞因子,包括干扰素-γ (IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α (TNF- α)和白细胞介素-21 (IL-21),在CD4情况下,这些细胞转化为T辅助1型(Th1)和T滤泡辅助细胞(TFH),而在CD8 T细胞情况下,这些细胞转化为细胞毒性T细胞1型(TC1)和细胞毒性T滤泡(TCF)细胞。此外,CCR4阻断后,抑制效应T细胞反应并参与CHB免疫抑制的T调节细胞(T regulatory cells, Tregs)的频率和功能下降。因此,CCR4可能是一个潜在的治疗靶点,可以增强慢性乙型肝炎患者的hbv特异性免疫,这是清除病毒所必需的。

患者及方法

研究参与者和样本

在书面知情同意后,共从46例慢性乙型肝炎患者和32例接种hbv疫苗的健康对照(vec - hc)中提取外周血样本,分别在肝素化和非肝素化管中采集。所有健康受试者均完成了HBV疫苗接种的标准疗程,且抗hbs抗体呈阳性。慢性乙型肝炎患者HBsAg阳性持续6个月以上,抗hbc抗体阳性,具有慢性乙型肝炎病毒感染的临床、生化和病毒学证据。慢性乙型肝炎患者的排除标准包括合并感染甲型肝炎病毒(HAV)、HCV、HDV、HEV和HIV。伴有自身免疫性肝病或任何其他已知肝脏合并症的患者被排除在本研究之外。研究方案由美国巴尔的摩马里兰大学机构审查委员会批准,研究遵循赫尔辛基宣言进行。表1总结了研究对象的人口学、临床和病毒学参数。从非肝素化的血液管中收集血清样本,将肝素化的血液样本在4000转/分离心5分钟后分离血浆。样品在- 80℃保存待用。采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法(GE Healthcare, Chicago, IL)从血液中分离外周血单个核细胞(PBMCs),直接使用或冷冻保存。在胎牛血清(FBS)中加入10%二甲亚砜进行低温保存,样品在- 140°C液氮中保存直至使用。

表1研究对象的人口学及临床参数

病毒学参数

招募入组后,检测HBsAg和HBV DNA水平。血清HBsAg定量使用高灵敏度的HBsAg化学发光免疫测定(CLIA)试剂盒(AutoBio Diagnostic CO. Ltd),按照前面在其他地方提到的程序进行。化学发光检测由Synergy H1平板阅读器(BioTek Instruments, Inc.)完成。对于HBV DNA的定量,血清样本被送到商业实验室,在那里通过实时荧光定量PCR对HBV DNA进行定量。

有关材料和方法的详细信息,请参阅附加文件1:材料S1。


目录

摘要
背景
患者及方法
结果
讨论
数据和材料的可用性
缩写
参考文献
致谢

作者信息
道德声明

补充信息



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结果

慢性乙型肝炎患者表现出较高的CCR4 ex随着HBsAg水平和纤维化评分的增加,T细胞的抑制也随之增加

趋化因子受体4主要由辅助性T细胞2 (Th2)表达,通过负性调节免疫反应诱导免疫抑制。我们检测了慢性乙型肝炎(CHB)患者不同T细胞亚群(包括CD4和CD8)上CCR4的表达,并将其与接种hbv疫苗的健康对照组(vac - hc)进行了比较。为了分析CCR4在CD4+和CD8+ T细胞上的表达,门控策略如图1A所示。我们的离体数据显示,CCR4在CHB患者CD4+和CD8+ T细胞上的表达高于vec - hc(图1B)。此外,我们比较了CHB和vac - hc中CCR4- CD4和CD8 T细胞的频率,发现与CHB相比,vac - hc中CCR4- CD4和CD8 T细胞的比例更高。由于已经研究了表达CD4细胞的CCR4,我们的目的是表征CHB患者中表达CD8 T细胞(CCR4+ CD8+)的CCR4的表型和功能。我们首先研究了HBV是否在CD8 T细胞上诱导CCR4表达有任何直接作用。因此,我们用HBs重叠肽刺激CHB患者的PBMCs 5天,并分析CD8 T细胞中CCR4表达的变化。我们发现,在大多数患者样本中,针对HBs肽,CD8 T细胞中的CCR4表达显著增强,这表明HBV可以直接触发CCR4表达(图1C)。为了证实CCR4的表达是否受到HBsAg水平的调节,我们将CHB患者按照HBsAg水平(低< 100,高< 10 000)进行分离,并检查CCR4+ CD8+ T细胞的频率。正如预期的那样,这些细胞在HBsAg水平较高的患者中明显更高(图1D)。此外,相关分析进一步揭示了HBsAg水平与CCR4表达之间的强相关性(图1E),这说明了HBsAg在CHB患者中诱导CCR4表达的作用。此外,我们研究了其他HBV病毒抗原如乙型肝炎核心抗原(HBcAg)是否可以在体外诱导CCR4表达,我们观察到少数患者在HBc肽刺激下CCR4表达增加(附加文件1:图S1)。由于CCR4+ CD4+ T细胞已被证明参与了2型免疫诱导的纤维化病理过程,CHB的并发症还包括纤维化、肝硬化和进一步发展为HCC,我们研究了CCR4+ CD8+ T细胞的频率在纤维化的不同阶段是否存在差异。使用FibroScan评分来定义纤维化的不同阶段。我们在纤维化评分较高(F3-F4)的患者中监测到CCR4+ CD8+ T细胞的频率高于评分较低(F0-F2)的患者(图1F)。同样,在纤维化评分较高(F3-F4)的CHB患者中,CCR4+ CD4+ T细胞的频率也增加,表明CCR4表达随着疾病进展而增加。进一步,我们检查如果CCR4 + CD8 + T细胞表达其它趋化因子受体CXCR3、CXCR5, CCR6 CCR10,我们观察到这些细胞表达趋化因子受体,其中前2高表达在慢性乙肝Vacc-HC相比(图1 g H)。我们进一步比较是否有差异表达的趋化因子受体CCR4 +和CCR4 - CD8 T细胞,我们注意到CCR4 + CD8 + T细胞选择性展览CXCR3的高表达,CXCR5和CCR6的表达比CCR4−CD8+ T的表达量要高,而CCR10的表达在两个亚群之间没有变化。

图1
figure 1

慢性乙型肝炎患者循环T细胞中CCR4表达较高。采用门控策略分析外周血单核细胞(PBMCs)中CCR4在CD4和CD8 T细胞上的表达。流式细胞术伪彩色图和散点图中的累积数据代表了体外条件下慢性乙型肝炎(CHB)患者(n = 37)和接种疫苗的健康对照(vac - hc) (n = 22)外周血单核细胞中CCR4+和CCR4 - CD4和CD8 T细胞的百分比频率。C代表性的流式细胞术图和线形图累积数据显示了CCR4在有和没有HBs重叠肽刺激的CHB患者中的表达(n = 10)。D低(< 100)和高(100万)乙肝患者CCR4+CD8+ T细胞的频率。E HBsAg水平与CCR4+CD8+ T细胞的相关性。F不同纤维化评分CHB患者CCR4表达CD4和CD8 T细胞的频率(F0-F2)和(F3-F4)。G, H代表性斑马图(G)和图中的汇总数据(H)说明了CHB患者PBMCs (n = 32)中不同趋化因子受体CXCR3、CXCR5、CCR6和CCR10在CCR4 + CD8 + T细胞上的表达,并与vec - hc (n = 20)和CCR4-CD8 + T细胞的比较。从CHB患者和Vacc-HC的pbmc中收集的说明性图(I)和图中的汇总数据(J)显示了CCR4+CD8+ T细胞上多种抑制受体PD1、CTLA4、2B4、TIGIT和TIM3的表达及其与CCR4-CD8 + T细胞的比较。通过检测CD69和Ki67的表达分析CCR4+CD8+ T细胞的早期活化和增殖。图中的所有数据都显示为带范围的中位数。P值< 0.05认为有统计学意义,定义如下:* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001

众所周知,慢性乙型肝炎患者具有耗尽的常规CD8+ T细胞,因为这些细胞上的抑制受体表达较高;因此,我们推测CCR4+CD8+ T细胞也可能表达抑制性受体。我们的研究结果表明,除了2B4外,这些细胞表现出更高的抑制受体表达,包括程序性死亡-1 (PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4 (CTLA4)、具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白和含黏蛋白结构域的蛋白3 (TIM 3),其中2B4在CCR4−CD8+ T细胞中表现得更好。当比较CHB和vec - hc之间这些抑制受体的谱时,前者组在CCR4+和CCR4 - CD8+ T细胞上的受体表达更高,表明这些细胞在表达抑制受体方面与传统CD8 T细胞相似(图1I, J)。接下来,我们通过分析CD69(早期激活标记物)和Ki-67(细胞增殖标记物)的表达来确定CCR4+ CD8+ T细胞的激活和增殖状态。数据显示,这些细胞高度活化,比CCR4−CD8+ T细胞具有更好的增殖能力(图1K)。总的来说,这些发现表明CCR4的表达随着疾病的进展而增加,HBs抗原触发了它们在CD8 T细胞中的表达。此外,CHB中的CCR4+ CD8+ T细胞在表型上与CCR4 - CD8+ T细胞和vec - hc不同。

CCR4+CD8+ T细胞在慢性乙型肝炎患者中维持免疫抑制特征

由于CCR4+CD8+T细胞在慢性乙型肝炎感染过程中尚未被研究,我们深入研究了这些细胞的功能特征,并将它们与CCR4 - CD8+T细胞进行了比较。在用HBsAg特异性重叠肽刺激PBMCs 5天后,我们检测了免疫抑制/免疫调节细胞因子的产生,包括IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和TGF-β1,我们发现CCR4+CD8+ T细胞在HBsAg肽刺激下比CCR4 - CD8+ T细胞产生更多的这些细胞因子(图2A, B),这表明这些细胞本质上是免疫抑制的,可能与CHB的免疫耐受有关。vec - hc中的CCR4+CD8+ T细胞也比CCR4 - CD8+ T细胞产生更高的免疫抑制细胞因子;然而,与慢性乙型肝炎患者相比要低得多(数据未显示)。CHB患者的血浆也证实这些细胞因子水平高于vec - hc,证实CHB患者处于免疫抑制状态(图2C)。接下来,我们确定CCR4+ CD8+ T细胞在本质上是否仅仅具有免疫抑制作用,或者它们是否也能够像传统的CD8+ T细胞一样产生抗病毒细胞因子。在本实验中,我们将PBMCs在HBsAg重叠肽和IL-2存在下扩增10天,并检查这些细胞产生抗病毒细胞因子的情况。数据表明,CCR4+CD8+ T细胞在CHB患者中主要不分泌hbsag特异性抗病毒细胞因子,包括IFN-γ、TNF-α和IL-21,而CCR4- T细胞分泌这些细胞因子。在8例患者中,只有1例患者显示出这些细胞因子的产生,另一方面,CCR4 - CD8+ T细胞在所有患者中都产生这些细胞因子(图2D),这表明在CHB中CCR4+CD8+ T细胞构成免疫调节表型。然而,这些细胞因子的血浆水平在CHB和vec - hc之间没有显著差异(图2E),这可能是由于血浆细胞因子不仅构成hbsag特异性细胞因子,而且代表了不受HBV阻碍的全局细胞因子库。CCR4的配体包括趋化因子配体17 (CCL17)和CCL22,主要由树突状细胞和巨噬细胞[22]产生。这些趋化因子参与Th2和T调节细胞(Tregs)的募集,并支持2型免疫反应,诱导慢性乙型肝炎患者的免疫抑制;因此,我们决定检查CCR4+CD8+T细胞是否参与CHB中CCL17的产生。我们注意到这些细胞比CCR4 - CD8+ T细胞更丰富地产生CCL17(图2F)。事实上,CCL17水平显著提高CHB患者的血浆水平(图2G),而CCL22水平在两组之间具有可比性。

图2
figure 2

CCR4 + CD8 + T细胞在慢性乙型肝炎中保留免疫抑制特征。描述性斑马图(A)和图中的汇总数据(B)阐明了HBs重叠肽刺激5天后CHB患者(n = 8)分泌CCR4+CD8+ T细胞的免疫调节/免疫抑制细胞因子(IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和TGF-β1)的百分比频率及其与体外条件下CCR4 - CD8+ T细胞的比较。没有HBs重叠肽刺激的细胞作为未刺激的对照。C采用Luminex技术,采用多重细胞因子头阵列法测定CHB和vac - hc患者血浆中免疫调节/免疫抑制细胞因子水平(每组8例)。D散点图中的集体数据显示,在用HBs重叠肽和IL-2刺激和扩增PBMC 10天后,CHB患者的抗病毒细胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL-21)产生CCR4 +和CCR4- CD8 + T细胞。在未受刺激的对照组中也添加IL-2 (n = 8)。E CHB和vac - hc患者血浆中抗病毒细胞因子水平(每组8例)。F流式细胞术和散点图确定了CHB患者(n = 5)在用HBs肽和IL-2刺激PBMC 10天后产生CCR4+CD8+ T细胞的趋化因子CCL17,并与CCR4 - CD8+ T细胞相比较。CHB和Vacc-HC血浆中的G趋化因子水平。H散点图中的汇总数据显示,在HBs肽和IL-2刺激CHB患者PBMC 10天后,CCR4+CD8+ T细胞的细胞毒功能(CD107a表达、穿孔素和颗粒酶B产生)。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001

由于传统的CD8 T细胞具有细胞毒功能,这在宿主防御病毒感染中是必不可少的,我们在HBs重叠肽和IL-2存在的PBMC培养10天后,通过分析CD107a表达和穿孔素和颗粒酶B的产生,来解码CHB患者CCR4+CD8+ T细胞的细胞毒能力。我们观察到这些细胞具有与CCR4 - CD8+ T细胞相似的CD107a表达水平,而穿孔素和颗粒酶B的产生明显较低(图2H)。总的来说,我们的数据显示CCR4+CD8+ T细胞主要通过产生大量的免疫调节细胞因子来维持慢性乙型肝炎患者的免疫抑制特征。此外,这些细胞缺乏抗病毒细胞因子反应,具有边际细胞毒活性。

mogamulizumab抗体阻断CCR4促进hbsag特异性抗病毒免疫反应在T细胞中

HBV特异性T细胞反应对控制HBV感染至关重要;然而,这些反应在慢性乙型肝炎患者中很弱,HBsAg被认为是与免疫反应受损相关的关键因素之一。获得与病毒清除相关的强大hbsag特异性免疫反应,并归因于实现功能性治愈;因此,我们专门研究了mogamulizumab抗体抗ccr4治疗是否对慢性乙型肝炎患者hbsag特异性T细胞功能的恢复有任何影响。为此,我们首先用不同浓度的抗CCR4抗体(1、10和20µg)孵育pbmc 5-10天,确定mogamulizumab抗体进行CCR4阻断实验的最佳浓度,然后用CD3、CD4、CD8和CCR4抗体对细胞进行染色,并通过流式细胞术分析CCR4的表达(详情见补充资料)。我们观察到20µg/ml mogamulizumab抗体最适合阻断CCR4受体(图3A),因此在所有CCR4阻断实验中都使用该浓度。接下来,我们评估了CD4+和CD8+ T细胞在有和没有抗ccr4抗体的情况下,在有和没有hbsag特异性重叠肽和IL-2的PBMCs扩增10天后,CD4+和CD8+ T细胞产生的hbsag特异性抗病毒细胞因子。我们观察到CCR4阻断后CD4+和CD8+ T细胞产生的IFN-γ和TNF-α显著增加,而IL-21的产生仅在CD4 T细胞中增强。CD4+和CD8+ T细胞反应的代表性流式细胞术图如图(图3B)所示,累积数据显示在折线图(图3C)中。CD4细胞室中IFN-γ和IL-21产生细胞的检出率高于CD8+ T细胞,而CD8 T细胞室中TNF-α产生细胞的检出率更高。未受刺激的对照组在CCR4阻断后显示抗病毒细胞因子分泌的微小增加(数据未显示)。此外,我们检查了CCR4阻断是否可以增强针对HBcAg的抗病毒细胞因子分泌,我们发现CD4和CD8 T细胞中HBcAg特异性抗病毒细胞因子分泌增加(附加文件1:图S2)。由于IFN-γ和TNF-α主要由辅助性T细胞1型(Th1)和细胞毒性T细胞1型(TC1)细胞产生,而IL-21则由辅助性T滤泡细胞(TFH)和细胞毒性T滤泡细胞(TCF)分泌,我们研究了CCR4阻断是否会使CD4+和CD8+ T细胞转向这些表型。有趣的是,我们观察到CCR4阻断使CD4+和CD8+ T细胞在CD4+细胞中向Th1和TFH细胞极化,在CD8+ T细胞群中向TC1和TCF细胞极化(图3D, E),这可能是通过在这些细胞中诱导更高的增殖,因为我们监测到在CCR4阻断后CD4和CD8 T细胞中Ki-67的更高表达(图3F)。此外,我们还研究了抗ccr4治疗是否能促进CD4+和CD8+ T细胞的早期活化;然而,在CCR4阻断后,我们没有看到任何这样的变化(图3F)。总的来说,这些发现表明抗ccr4治疗逆转了hbsag特异性CD4+和CD8+ T细胞的功能损伤,并增强了这些患者消除病毒所需的抗病毒免疫反应。

图3
figure 3

使用抗CCR4抗体Mogamulizumab阻断CCR4,可增强慢性乙型肝炎患者T细胞中hbsag特异性抗病毒免疫反应。有代表性的流式细胞术图显示CCR4有和没有mogamulizumab抗体(20µg/ml)的表达。B, C流式细胞术图和线形图显示了在存在和不存在抗ccr4抗体的情况下,CD4和CD8 T细胞在HBs (n = 6例)重叠肽和IL-2的PBMC培养10天后产生的抗病毒细胞因子。D、E CCR4阻断前后CXCR3、CXCR5在CHB患者CD4、CD8 T细胞上的表达分析,检测Th1、TFH细胞(CD4)、TC1、TCF细胞(CD8)频率的变化。F CHB患者PBMC样本中CD69和Ki67在CD4和CD8 T细胞上表达的直方图和线形图,CCR4抑制和不抑制。G折线图描述了在使用抗CCR4抗体阻断和不阻断HBs重叠肽的情况下,PBMC培养5天后免疫调节/免疫抑制细胞因子产生CD4和CD8 T细胞的百分比频率。CCR4阻断后CD4和CD8 T细胞抑制受体H的表达分析。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001

由于T细胞损伤的程度也由免疫抑制细胞因子的水平决定,我们质疑抗ccr4治疗是否会增加针对HBsAg的免疫抑制细胞因子的产生,从而限制效应T细胞的反应。我们测试了CD4+和CD8+ T细胞在抗CCR4和不抗CCR4治疗的情况下产生的免疫抑制因子,包括IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和TGF-β1,发现阻断CCR4并不会促进CD4+和CD8+ T细胞产生任何免疫抑制因子(图3G)。事实上,抑制CCR4可降低CD4细胞中hbsag特异性TGF-β1的产生;因此,可能限制免疫耐受,消除抗ccr4治疗诱导抗病毒免疫抑制的风险。

鉴于抑制受体的免疫检查点阻断恢复hbv特异性T细胞应答,我们研究了抗ccr4治疗是否可以抑制这些抑制受体在CD4+和CD8+ T细胞上的表达。我们分析了PD-1、CTLA4、2B4、TIGIT和TIM3等多种抑制受体在CCR4阻断和不阻断CD4+和CD8+ T细胞上的表达;然而,在CCR4阻断后,我们没有观察到CD4+和CD8+ T细胞上这些抑制性受体的表达有任何减少(图3H),这表明CCR4可能与抑制性受体的表达无关,因此在CCR4阻断后不会改变这些受体的表达。

mogamulizumab抗ccr4治疗可改善T细胞中hbsag特异性细胞毒功能

细胞毒性T细胞通过表达脱颗粒标志物CD107a,释放穿孔素和颗粒酶b等细胞毒性蛋白,诱导细胞凋亡通路,使效应CD8+ T细胞有效杀伤病毒感染细胞,这些功能在CHB患者中减弱。因此,我们确定抗ccr4治疗是否可以增强T细胞的细胞毒性功能。众所周知,CD8 T细胞具有细胞毒性功能;然而,最近已经确定CD4+ T细胞的一个亚群也具有细胞毒性,这表明它们能够分泌穿孔素和颗粒酶B以MHC ii类限制的方式杀死靶细胞[B]。因此,我们检测了CD4+和CD8+ T细胞的细胞毒性功能。考虑到这些蛋白也在自发条件下表达,我们用hbsag特异性重叠肽刺激细胞,然后检查这些分子的表达。我们发现慢性乙型肝炎患者的CD4+ T细胞具有细胞毒性功能,如CD017a表达和穿孔素和颗粒酶B的产生;尽管它们远低于CD8+ T细胞,并且对HBsAg的反应略有增加(图4A)。值得注意的是,CCR4阻断显著增加了CD4+和CD8+ T细胞中CD107a+细胞的频率和穿孔素的产生;然而,颗粒酶B的产生并没有改善(图4A-C),这表明阻断CCR4有利于改善整体T细胞功能,包括抗病毒细胞因子反应和可能有助于HBV清除的细胞毒性潜能。

图4
figure 4

抗ccr4抗体治疗可增强慢性乙型肝炎T细胞的细胞毒功能。流式细胞术示例图显示,在存在或不存在抗CCR4抗体的情况下,用HBs重叠肽和IL-2刺激和扩增PBMC 10天后,CCR4阻断对CD4和CD8 T细胞细胞毒性电位恢复的影响。线形图描述了CCR4抑制和不抑制CHB患者CD4和CD8 T细胞的细胞毒功能(CD107a表达、穿孔素和颗粒酶B)。*p < 0.05

阻断CCR4可抑制T调节细胞的发育和效应功能

调节性T细胞是一种特殊的T细胞亚群,通过抑制T细胞增殖和细胞因子分泌来抑制免疫反应,维持体内平衡和自我耐受。然而,Tregs的加重反应可以抑制T细胞免疫,导致病毒持续存在。在慢性乙型肝炎中,Tregs与免疫反应受损有关。我们的数据显示在CHB患者中CD4+FoxP3+Tregs的频率增加(图5A, B),这与之前的研究一致[10]。这些CD4 + FoxP3 + treg在中枢记忆(CM)和naïve细胞群中所占比例较低,主要富集于效应记忆(EM)和终末分化效应记忆(TEMRA)细胞中(图5C),这也反映在CHB患者中这些细胞产生较多的IL-10和TGF-β1(图5E),证实了这些患者中功能性效应treg的扩增。近年来,在不同的实验系统中发现了CD8+ treg的存在。与CD4+ treg类似,这些细胞也具有一定的调节特性并参与免疫调节;因此,我们研究CHB患者是否也携带CD8+ Tregs。我们的数据显示,CHB患者确实具有CD8+FoxP3+Tregs,并且确实比vac - hc保留更高的频率(图5A, B)。由于Tregs在CHB患者的免疫抑制中起关键作用,并且与这些患者的病毒持久性有关;我们研究了抑制CCR4是否可以控制Tregs的免疫抑制功能。值得注意的是,我们观察到CCR4阻断后CD4+和CD8+ treg的频率显著下降(图5D)。重要的是,这些细胞也减少了hbsag特异性TGF-β1的产生,而IL-10的产生保持稳定(图5E-G)。抗CCR4治疗后Tregs和TGF-β1产生的减少,提示Tregs的发育和效应功能需要CCR4,其阻断可能会补贴Tregs的hbsag特异性免疫调节功能,从而在控制CHB患者的免疫抑制环境方面受益。CCL17, CCR4的一个配体,使Tregs募集到感染部位,在那里它们通过TGF-β1的产生诱导免疫抑制;因此,我们研究了CCR4阻断是否可以控制T细胞分泌hbsag特异性CCL17,我们发现CCR4阻断后CCL17的产生显著减少,这可能进一步有助于限制CHB患者的Tregs效应功能(图5H)。此外,CCR4阻断后,抗HBcAg的CCL17产生也减少(附加文件1:图S3)。

图5
figure 5

CCR4的中和可阻止CHB中T调节细胞的发育和效应功能。A, B Vacc-HC和CHB患者外周血中CD4T调节细胞(CD4Tregs)和CD8Tregs百分比的离体分析。C体外条件下CHB患者不同CD4Tregs亚群的频率(Naïve: CCR7+CD45RO−,EM: CCR7−CD45RO+, CM: CCR7+CD45RO+, TEMRA: CCR7-CD45RO−)及其与Vacc-HC的比较。EM:效应存储器;CM:中央存储器;终端分化效应存储器。D使用抗CCR4抗体中和CCR4和不中和CCR4的HBs重叠肽,在PBMC培养5天后treg的百分比。E - G代表性流式图(E)和线形图(F, G)显示了在HBs肽存在下培养5天后,免疫抑制细胞因子(IL-10和TGF-β1)产生和不产生CCR4抑制treg的频率。在CCR4阻断存在和不存在的情况下HBs肽对hccl17产生的响应。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001

讨论

在本研究中,我们报道用mogamulizumab抗体阻断CCR4有效地恢复抗病毒免疫反应,并限制可能有助于清除HBV的Tregs介导的免疫抑制。慢性乙型肝炎患者清除HBV的主要障碍之一是适应性免疫功能失调,其特征是HBV特异性T细胞的强烈衰竭。一般来说,HBV特异性CD8+细胞毒性T细胞被认为是根除HBV感染的核心角色,这一点被实验感染的黑猩猩在病毒血症高峰时CD8+ T细胞的耗尽所证实,这延迟了病毒清除,直到CD8+ T细胞[26]的恢复。在慢性HBV感染患者中,HBV特异性CD8 T细胞的反应在数量和质量上都较弱,并且一致认为效应CD8 T细胞有不同程度的衰竭,如(1)增殖能力降低,(2)抗病毒细胞因子产生减少,(3)细胞毒功能差,(4)抑制受体的持续高表达。此外,hbv特异性CD4+ T细胞功能也受损,阻碍了hbv特异性CD8+ T细胞的激活和维持,并阻碍了hbv特异性体液反应[27]的产生。因此,我们确定抗ccr4抗体治疗是否有助于逆转慢性乙型肝炎患者不同程度的免疫衰竭。通常,CCR4在CD4+ T细胞的Th2和Tregs亚群上表达,这些亚群主要与免疫调节有关;然而,这些细胞的过度活化导致慢性乙型肝炎患者产生免疫耐受。我们的研究结果表明,在CHB中,CD4+和CD8+ T细胞室中表达CCR4的细胞频率更高,这可能是由于它们的增殖能力更高,因为我们发现这些细胞上表达了更多的Ki-67。由于CCR4+CD4+ T细胞已经在不同的疾病环境中被表征,并且关于CCR4在慢性乙型肝炎中对CD8 T细胞的作用的数据不足,我们首先关注了CCR4+CD8+ T细胞的表征,并发现这些细胞在慢性乙型肝炎感染过程中基本具有免疫调节功能。与产生更多IFN-γ和TNF-α的传统CD8+ T细胞不同,CCR4+CD8+ T细胞通常产生免疫抑制因子,包括IL-4、il - 5、il - 10、IL-13和TGF-β1,缺乏抗病毒细胞因子反应,尽管它们比CCR4 - CD8+ T细胞保留部分细胞毒功能,证实了这些细胞在CHB中的调节作用。重要的是,CCR4+CD8+ T细胞在HBsAg水平和纤维化评分较高的患者中逐渐增加,表明它们在疾病进展中的作用。事实上,体外数据显示HBsAg可以直接触发CD8 T细胞中的CCR4表达。已有报道称,表达Th2的CCR4细胞通过分泌IL-4和IL-13参与纤维化[28,29]。我们发现CCR4+CD8T分泌IL-4和IL-13以及其他促纤维化细胞因子TGF-β1的产生不仅提示了这些细胞在纤维化中的作用,而且支持这些细胞可能具有临床意义。此外,与CCR4 - CD8+ T细胞相比,CCR4+CD8+ T细胞存在几种抑制性受体,其表达明显高于CCR4 - CD8+ T细胞,这与传统CD8 T细胞的衰竭有关。

在体外环境下,阻断CCR4揭示了有希望的数据,显示其逆转CD4和CD8 T细胞中各种水平的免疫功能障碍的潜力,我们在以下几点中讨论过。

  1. (1)

    T细胞增殖:T细胞增殖是抗原特异性T细胞克隆扩增并进一步转化为效应细胞的关键步骤,这是建立有效T细胞应答bb0的基本要求。在慢性乙型肝炎中,T细胞增殖能力受损,主要是针对HBsAg, CD8 T细胞的增殖能力比CD4亚群[31]更严重。因此,实现抗原特异性T细胞功能恢复的第一步是恢复其增殖能力,我们发现抗ccr4治疗可提高CD4和CD8 T细胞亚群的增殖能力(图3F)。

  2. (2)

    抗病毒细胞因子分泌:T细胞转化为效应细胞后,发挥细胞因子分泌等多种功能;然而,慢性乙型肝炎患者的抗病毒细胞因子分泌严重受损,特别是在对HBsAg的反应中,这导致了持续的病毒感染bbb。考虑到抗病毒细胞因子分泌是成功消除病毒的最关键步骤之一,因此迫切需要有助于改善抗病毒细胞因子反应的策略。阻断CCR4可显著增强CD4和CD8 T细胞中抗病毒细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-21的分泌,使CD4和CD8 T细胞向Th1和TFH分化,CD8 T细胞向TC1和TCF分化(图3B-E)。重要的是,IL-21分泌的增强将支持HBV特异性体液反应的发展,以产生针对HBV的中和抗体。此外,阻断CCR4并不会诱导免疫抑制细胞因子的产生,从而消除了抗CCR4治疗在这些患者中诱导免疫抑制的可能性。

  3. (3)

    细胞毒性功能:效应T细胞的另一个关键功能是杀死病毒感染的细胞,这是由溶酶体相关膜蛋白-1 (Lamp-1),也称为CD107a和细胞毒性颗粒(包括穿孔素和颗粒酶B)执行的,它们介导凋亡途径[32]的激活。这些功能在慢性乙型肝炎感染中受损,其恢复是成功消除病毒感染细胞的另一个里程碑。我们的数据表明,CCR4抑制能有效地恢复T细胞的细胞毒性潜能,包括CD107a表达和穿孔素分泌,这将允许有效地杀死病毒感染的细胞,从而有助于减少病毒载量。总体结果汇总在图6中。

图6
figure 6

乙型肝炎病毒感染诱导免疫抑制和效应T细胞功能衰竭,驱动持续性慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染。表达CCR4的T细胞通过限制T细胞中hbv特异性抗病毒反应和支持Tregs功能来促进免疫抑制。阻断CCR4可逆转T细胞的免疫衰竭并限制Tregs的免疫抑制活性

耗尽T细胞的另一个特征是表达多种抑制受体,从而导致T功能缺陷[33]。研究的重点是免疫检查点抑制剂来拯救T细胞功能;因此,我们测试了抗ccr4抗体治疗是否可以降低这些抑制性受体的表达;然而,CCR4阻断不能实现这一点。靶向抑制受体的目标是实现T细胞的功能恢复,无论如何都是通过CCR4阻断来实现的;因此,在这方面不要强加任何顾虑。总的来说,我们的数据显示,CCR4阻断在包括CD4和CD8 T细胞在内的hbsag特异性T细胞中各种水平的免疫功能障碍的整体恢复中是有效的,这可能有助于HBV清除。

抑制hbv特异性免疫的另一个机制是主要由Tregs驱动的免疫耐受性/免疫抑制环境的扩大。一般来说,Tregs通过各种机制,包括IL-10和TGF-β1的产生,通过抑制抗原特异性或抗原非特异性T细胞反应来维持免疫平衡;然而,较高的treg扩增诱导免疫抑制,导致病毒持续存在。因此,清除Tregs可能是恢复效应T细胞功能的一种好方法。事实上,研究表明,循环treg比例的下调有助于恢复抗病毒免疫反应[34]。我们的数据显示,CHB中Tregs的表达频率较高,这些细胞主要富集于效应和终末分化的效应记忆细胞,并产生较高的IL-10和TGF-β1。这些细胞因子不仅引起免疫抑制,而且与CHB进一步发展为纤维化、肝硬化和肝细胞癌密切相关。引人注目的是,CCR4阻断降低了Tregs的频率和功能。TGF-β1是参与纤维化进展和HCC发生的关键分子,在CCR4阻断后显著下降,提示CCR4是控制Tregs介导的免疫抑制和肝脏疾病进展的关键靶点。

在几种与肿瘤生长、侵袭、迁移甚至转移相关的癌症中,已经观察到CCR4表达上调,并将其作为包括HCC在内的各种癌症的关键靶点[17,28,35]。除CCR4外,其配体CCL17和CCL22在肝癌中表达升高,促进Tregs细胞向肿瘤浸润,通过产生TGF-β1抑制抗癌免疫,进一步为肿瘤生长建立良好的微环境[36,37]。我们的数据报道了CCR4阻断后CCL17的产生减少,这反过来会阻碍Tregs功能,包括TGF-β1的产生,从而抑制这些患者的免疫抑制。鉴于CCR4在各种癌症(如HCC)中发挥着关键作用,抗CCR4抗体(包括mogamulizumab)正被用于增强抗癌免疫[38]。我们的数据揭示了一个重要的发现,即CCR4的表达在终末期肝病(如HCC)期间不会直接上升,但在疾病的早期阶段(如CHB)往往会增加,并随着疾病进展而增加;因此,在早期阶段阻断CCR4可能更有利于控制疾病向终末期疾病发展,至少在慢性乙型肝炎感染的情况下是这样。慢性乙型肝炎患者通常需要长期使用核苷类似物(NAs)治疗,这使他们面临耐药性的风险。此外,停用NAs可能导致HBV再激活[40];因此,针对短时间内实现功能性治愈的治疗策略可以避免长期使用NAs的并发症,NAs与抗ccr4联合治疗可以作为治疗这些患者的一种选择。

总之,我们的研究为CCR4在CHB感染中的作用提供了新的重要信息,并证明CCR4是CHB患者hbv特异性T细胞免疫功能障碍的主要参与者,其阻断可恢复各种水平的免疫功能障碍,如细胞增殖,抗病毒细胞因子分泌和细胞毒性T细胞功能。此外,CCR4抑制限制了treg的表型和功能,这将进一步有助于改善病毒消除所需的抗原特异性T细胞功能,因此CCR4可以作为治疗慢性乙型肝炎患者的潜在治疗靶点。

补充信息

AdditioNal文件1:

材料与方法表S1。图S1:乙型肝炎核心抗原(HBc)诱导慢性乙型肝炎患者CCR4表达。线形图表示HBc肽刺激CHB患者PBMC 5天后CD8 T细胞上CCR4的表达。没有任何HBc刺激的pbmc作为对照。图S2。Mogamulizumab(一种抗CCR4药物)阻断CCR4,可增强慢性乙型肝炎患者T细胞中的hbv特异性免疫反应。(A, B)流式细胞术图和折线图显示了HBc重叠肽和IL-2刺激PBMC 10天后,CD4和CD8 T细胞在抗ccr4抗体存在和不存在的情况下产生的抗病毒细胞因子。图S3。Mogamulizumab阻断CCR4可抑制T细胞产生CCL17。折线图显示在抗ccr4抗体存在和不存在的情况下,CCL17在HBc肽和IL-2刺激下产生10天。



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