2023-04-27 12:30

香烟烟雾与下一代烟草和尼古丁产品提取物对人类单核细胞炎症生物标志物影响的比较研究

摘要

单核细胞表现出促炎表型,在动脉粥样硬化斑块的粘附和发展中起关键作用。作为吸烟的替代品,下一代烟草和尼古丁产品(NGP)现在被广泛使用。然而,它们对单核细胞的促炎作用知之甚少。我们研究了暴露于加热烟草制品(HTP)、电子烟(e- cigg)、传统香烟(3R4F)和纯尼古丁(nic)的水烟提取物(AqE)后THP-1单核细胞的细胞活力、抗氧化和促炎基因和蛋白表达。3R4F治疗以剂量依赖的方式降低了细胞活力,而暴露于替代吸烟产品与对照组没有差异。在3R4F最高非致死剂量(20%)时,与对照组相比,3R4F、HTP和e-cig的mRNA表达分别发生了以下显著变化;HMOX1(6倍、< 2倍、< 2倍)、NQO1(3.5倍、< 2倍、< 2倍)、CCL2(4倍、3.5倍、2.5倍)、IL1B(4倍、3倍、< 2倍)、IL8(5倍、2倍、2倍)、TNF(2倍、2倍、< 2倍)和ICAM1的所有产物均低于2倍阈值。在蛋白表达方面,IL1B(3倍、< 2倍、< 2倍)和IL8(3.5倍、2倍、2倍)的表达均高于2倍阈值,而CCL2、TNF和ICAM1的表达均低于2倍。在高剂量下,所有提取物的诱导作用都更大;然而,NGP的反应通常低于3R4F。总之,所有产品都能激活抗氧化和促炎过程。总的来说,ngp的反应比暴露于3R4F aqqe的THP-1细胞要低。

介绍

吸烟是动脉粥样硬化发生的关键刺激因素[29,42,50]。动脉粥样硬化发生的关键一步是内皮功能障碍的发展。在这一早期阶段,动脉粥样硬化病变一侧表现出促炎表型,其特征是表达谱改变、炎症生物标志物增加、内皮屏障功能受损以及单核细胞与内皮细胞的粘附。因此,单核细胞对内皮的活化和粘附在动脉粥样硬化中起主要作用。一些研究表明,在主要行为风险因素吸烟的情况下,内皮细胞和单核细胞的动脉粥样硬化相关基因表达谱[3,34,41,73,77]。在之前的一项研究中,研究人员发现,传统参考香烟(3R4F)的水烟提取物(AqE)的独立刺激显示出对单核细胞的细胞毒性、氧化和促炎作用。

吸烟导致氧化应激并介导活性氧(ROS)的产生,而活性氧是动脉粥样硬化过程中烟雾诱导血管炎症的关键介质。NADPH氧化酶家族是细胞ROS的主要来源之一。在单核细胞中,NADPH氧化酶异构体2 (NOX2),也称为细胞色素b-245 β链(CYBB),是产生超氧阴离子(O2−)的氧化应激的主要来源和标记物[8,32,45]。NOX2产生超氧阴离子(O2−)已被证明参与内皮功能障碍和动脉粥样硬化bbb的发展。作为对这些氧化损伤的保护,细胞具有非常有效的抗氧化修复和防御机制[5,17,20,65,72]。转录因子NRF2 (NFE2L2)是细胞适应氧化应激的主要介质。NRF2被氧化刺激激活,并起到防止细胞内氧化还原失衡的作用。激活后,NRF2与解毒和抗氧化靶基因调控区域的抗氧化反应元件(ARE)结合,如血红素加氧酶(去环)1 (HMOX1)和NAD(P)H脱氢酶(醌1)(NQO1),并调节其转录[13,44]。血管炎症过程伴随着促炎表型,其特征是细胞间粘附分子1 (ICAM-1)、血管细胞粘附分子1 (VCAM-1)、选择素E (SELE)、血小板和内皮细胞粘附分子1 (CD31)等关键标志物的激活[16,25,33,39]。急性暴露于香烟烟雾诱导炎症反应,炎症细胞的早期激活和相应的各种炎症介质[42]的释放。C-C基元趋化因子配体2 (CCL2/MCP1)是一种单核细胞特异性表面标志物,可加速动脉粥样硬化,并在动脉粥样硬化病变中表达增加[2,40]。此外,各种炎症细胞因子,如白细胞介素1- β (IL1B)、白细胞介素8 (CXCL8)和肿瘤坏死因子α (TNF)在体内和体外吸烟条件下的表达和分泌均升高[14,49,74]。

在过去的几年里,我们在细胞水平上深入研究了吸烟对动脉粥样硬化进展的影响。首先,我们开始研究传统吸烟对内皮细胞和人类单核细胞的影响。这些细胞类型不断暴露并直接受到循环烟雾介导的有毒物质和血液中的活性氧的影响,并介导了动脉粥样硬化发生的重要步骤和最初步骤[9,26]。

减少吸烟有害副作用的一种策略是开发下一代烟草和尼古丁产品(NGP)[63]。在过去几年中,基于加热而不是燃烧烟草的吸入尼古丁的电子烟(e- cigg)以及加热烟草制品(HTP)被发明出来[30,61]。这些新开发的烟草和尼古丁产品被认为是传统香烟的“更安全的替代品”,危害更小[37,47,48,51,62,69,71]。然而,关于下一代烟草和尼古丁产品(NGP)在细胞活力、氧化应激和血管中细胞向促炎表型转换方面的实际有害潜力,我们知之甚少。因此,我们在接下来的研究中研究了ngp对内皮功能[27]和单核细胞功能的影响。

材料与方法

本研究为后续研究。因此,以下各节只提供简短的信息。关于本研究使用的材料和方法的详细描述,请参考我们之前的出版物[9,26,27]。

细胞培养

本研究使用人THP-1单核细胞(ATCC# TIB-202)。细胞在rpm -1640培养基中(添加10%胎牛血清、10万U/L青霉素、100 mg/L链霉素)最多培养8周。每隔2-3天,将THP-1细胞(比例1:8)在新鲜培养基中分裂,进一步培养[9,12,70]。

水烟萃取物的生产和增产

3R4F参考香烟,一种加热烟草制品(HTP;iQOS)和尼古丁产品(电子烟;VYPE),在本研究中使用(详细信息请参见表1)。所有测试产品都按照相应的膨化制度进行机器膨化(表1)。所有水烟提取物(AqE)都是通过不含酚红的M199介质鼓泡演变烟雾产生的。这个程序提供了100%的原液。尼古丁浓度如表2所示[7,27]。

表1测试产品规格和水烟萃取物(AqE)生成参数
表2不同co中尼古丁含量烟草和尼古丁制品的水萃取物和纯尼古丁溶液的浓度(对照)

在指定的时间内,THP-1细胞暴露于不断增加的AqE剂量(0 - 88.3%)的3R4F、HTP、电子烟和纯尼古丁(对照组)。每个样本都有一个没有额外刺激的对照(时间匹配对照)[27]。

细胞活力测定

培养后,将单核细胞接种于96孔板(每孔25000个细胞),用不同的测试物质(0- 88.3%)刺激24h。进行细胞活力测定(CellTiter-Glo Luminescent Cell viability assay, Promega)并检测发光发射[9,26,27]。

实时聚合酶链反应

单核细胞接种(每孔/ 24孔板7万个),用3R4F、HTP、电子烟或纯尼古丁(0- 88.3%)的AqE刺激24小时。治疗后,分离总RNA (High Pure RNA Isolation Kit/Roche Diagnostics),并将mRNA逆转录为cDNA (Superscript II reverse Transcriptase/Thermo Fisher Scientific)。对于qPCR,使用GoTaq qPCR Master Mix (Promega)与基因特异性引物(表3)。每次运行都伴随着熔化曲线分析,以确保单个扩增产物。采用恒定内参基因表达条件下实时PCR相对表达比数学模型对数据进行评估[9,26,27,53]。

表3用于分析人类基因ex的引物实时聚合酶链反应

多路复用enzyme-l墨联免疫吸附试验

单核细胞接种(每孔/24孔板7万个),用3R4F、HTP、电子烟或纯尼古丁(0- 88.3%)的AqE刺激24小时。制备全细胞提取物(RIPA Buffer/Cell signaling),测定蛋白质浓度(BCA protein Assay Reagent/Perbio Science)[26,27]。

使用基于电化学发光的Mesoscale Discovery (MSD) V-Plex检测平台(Mesoscale Discovery, Gaithersburg, MD, USA)对炎症生物标志物进行量化。蛋白质样本使用血管损伤小组2(人)试剂盒(ICAM1)、趋化因子小组1(人)试剂盒(CCL2)和促炎小组1(人)试剂盒(IL1B、IL8、TNF)进行分析。

简要分析如下:按照制造商的说明制备分析物检测板;在井中加入连续稀释的校准器和重复的测试样品;振荡孵育1h;制备SULFO-TAG标记的检测抗体溶液;洗盘子;每孔加入相应的检测抗体混合液;振荡孵育1h;洗盘子;为每个井添加读缓冲。最后,使用MSD板阅读器(MESO QuickPlex SQ 120)检测板。


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介绍
材料与方法
结果
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相关的内容

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结果

3R4F介导而非ngp介导对人单核细胞活力的细胞毒性作用

首先,研究了不同类型的水萃取物(AqE)可能产生的有害影响。人THP-1单核细胞暴露于增加剂量的3R4F、HTP、电子烟和nic中,剂量从10%到88.3%不等,持续24小时。与未刺激的对照相比,30%或更高剂量的3R4F以剂量依赖的方式降低了单核细胞的活力。与对照组相比,所有其他测试试剂在细胞活力方面没有显示差异(图1)。

图1
figure 1

3R4F介导而非ngp介导对人单核细胞活力的细胞毒性作用。使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法评估静态条件下单核细胞的活力和水提取物的指示剂量。THP-1单核细胞用指定烟草制品的水提取物在10%至88.3%的浓度范围内刺激24小时。数据显示为平均值(时间匹配对照的%)±SD。统计学:单因素方差分析,*p < 0.05 vs.时间匹配对照,#p < 0.05, n≥9

抗氧化信号通路被烟草和尼古丁产品的AqEs激活

细胞适应氧化应激的主要介质是NRF2系统。该系统的激活是细胞在氧化应激情况下生存的关键反应。THP-1细胞暴露于剂量增加的测试物质中,激活了NRF2抗氧化防御系统。虽然转录因子NRF2本身的mRNA表达在AqE刺激下保持不变(图2a),但NRF2靶基因HMOX1和NQO1的表达显示出剂量依赖性诱导(图2b, c)。这里,对替代烟草和尼古丁产品的反应通常低于3R4F刺激,但仍显示NRF2抗氧化防御系统的剂量依赖性激活。

图2
figure 2

抗氧化信号通路被烟草和尼古丁产品的AqEs激活。在剂量依赖性刺激24小时后,测定静态条件下NRF2 (a)、HMOX1 (b)、NQO1 (c)和NOX2 (d)的mRNA表达量。数据显示为平均值(x倍时间匹配对照)±SD。统计学:单因素方差分析*p < 0.05 vs.时间匹配对照,#p < 0.05, n≥4

NADPH氧化酶2 (NOX2)作为单核细胞氧化应激的主要标志物,在3R4F、HTP和电子烟处理后,其mRNA水平略有上调。暴露于纯尼古丁溶液中对NOX2没有恒定的影响(图2c)。

粘附分子ex暴露于所有测试产品的烟雾提取物后,会引起压力

单核细胞附着在血管壁上是动脉粥样硬化进展的关键步骤,反映了细胞炎症状态。这种单核细胞对内皮细胞的粘附主要是通过内皮细胞和单核细胞两侧粘附分子的表达来介导的。在THP-1细胞中,ICAM1基因表达对所有测试的烟草和尼古丁水提取物均有短暂的增加(图3a)。对全细胞裂解物中ICAM1蛋白表达的进一步分析显示,暴露于烟草和尼古丁产品的水提取物后,ICAM1蛋白表达呈剂量依赖性增加,然而,由于高度变异性,没有达到统计学意义。由于3R4F刺激下细胞活力显著降低,在70%及更高剂量的3R4F孵育后,无法确定ICAM1蛋白的表达。相比之下,纯尼古丁治疗在刺激24小时后对ICAM1没有影响(图3b)。

图3
figure 3

在暴露于所有测试产品的烟雾提取物后,诱导粘附分子表达。在剂量依赖性刺激24小时后,测定静态条件下ICAM1 (a, b)和CCL2 (c, d)的mRNA和蛋白表达。数据显示为平均值(x倍静态时间匹配对照)±SD。统计学:单因素方差分析,*p < 0.05 vs.时间匹配对照,#p < 0.05, n≥4

在动脉粥样硬化的进展中,几种促动脉粥样硬化和促炎症细胞因子负责诱导局部炎症和免疫细胞的募集。其中一个标记是趋化因子CCL2/MCP1。在本研究中,与尼古丁治疗相比,3R4F治疗THP-1单核细胞24 h后CCL2基因表达上调。替代烟草和尼古丁制品在较高的AqE浓度(≥70%)下诱导CCL2基因表达。纯尼古丁没有导致CCL2的调节(图3c)。在蛋白水平上,CCL2在3R4F治疗后也呈剂量依赖性显著上调。HTP、电子烟和nic刺激的趋势相同,但没有达到统计学意义(图3d)。70%及以上剂量的3R4F刺激无法检测CCL2蛋白表达。

用不同烟草制品的AqEs处理可调节促炎信号通路

其他重要的介质是促炎细胞因子白细胞介素1 β (IL1B),趋化因子(C-X-C Motif)配体8 (CXCL8,也称为白细胞介素8 (IL8))和肿瘤坏死因子(TNF)。

用所有烟草/尼古丁产品的AqEs刺激THP-1细胞,il - 1b mRNA和蛋白表达上调(图4a, b)。刺激24小时后,尼古丁处理也增加了il - 1b mRNA的表达。在所有烟草/尼古丁产品的水熏提取物刺激后,IL8的表达结果与IL1B相似。3R4F、HTP和电子烟诱导IL8 mRNA和蛋白表达。尼古丁处理对il - 8的影响很小(图4c、d)。图4e、f显示,3R4F、HTP和电子烟刺激24小时后,TNF mRNA和蛋白的表达呈剂量依赖性诱导。相反,尼古丁处理对TNF表达没有影响。

图4
figure 4

用不同烟草制品的AqEs处理可调节促炎信号通路。在剂量依赖性刺激24小时后,测定静态条件下IL1B (a、b)、IL8 (c、d)和TNF (e、f)的mRNA和蛋白表达。数据显示为平均值(x倍静态时间匹配对照)±SD。统计学:单因素方差分析,*p < 0.05 vs.时间匹配对照,#p < 0.05, n≥4

总的来说,所研究的促炎细胞因子的表达模式表明,与3R4F刺激相比,NGP治疗延迟诱导。

讨论

吸烟增加了死亡率,这是心血管疾病最重要的风险因素之一,也是最可预防的单一风险因素。下一代烟草和尼古丁产品(NGP)的使用,如电子烟(e- cigg)和加热烟草产品(HTP)的使用,是近年来的一个新兴趋势。香烟通常被认为是传统香烟的“更安全的替代品”,但人们对它们对血管内皮的潜在有害影响知之甚少。因此,应该仔细研究这些影响。在这项研究中,我们在体外研究了传统香烟与下一代烟草和尼古丁产品(NGP)对人类单核细胞的影响。为了获得ngp实际有害影响的详细信息,本研究分析了暴露于不同吸烟产品后细胞活力、氧化应激和单核细胞炎症状态的参数。

人类THP-1单核细胞被用作模拟单核细胞在血管中的功能和调节的模型。单核细胞系THP-1是一种被广泛接受的模拟血管中单核细胞功能和调控的模型[21,58]。我们之前的一项研究比较了传统3R4F参考香烟烟雾提取物对THP-1单核细胞和新鲜分离的原代人单核细胞[9]的影响。因此,我们在两种细胞类型之间显示了可比较的结果。基于这些发现,THP-1细胞的均匀遗传背景,高生长速率和无限可用性,我们推荐使用THP-1细胞进行筛选试验。

细胞活力的测定是产品筛选的一个常见的关键参数,并给出了测试化合物的细胞毒性的初步结果。基于我们自己之前对原代内皮细胞和单核细胞、不同香烟烟雾提取物剂量和不同时间点的测试,我们决定在本研究中使用基于atp的细胞活力测定来研究下一代烟草和尼古丁产品的影响[9,26,27]。因此,与3R4F AqE相比,替代尼古丁/烟草产品似乎对THP-1单核细胞具有轻微的细胞毒性作用。对于3R4F,当剂量≥30%时,细胞活力显著降低。其他研究通过比较传统香烟和NGP的细胞毒性得出了类似的结论。在最近的研究中,类似浓度的AqE被用于研究内皮细胞的促炎表型和细胞死亡的诱导[31,57,78]。

内皮功能障碍和动脉粥样硬化发生的关键因素是氧化应激和炎症状态。香烟烟雾本身含有不同数量的自由基,会对血管产生各种负面影响。此外,吸烟诱导的细胞内ROS生成导致氧化应激[6,59,75],从而通过促进炎症基因表达进而激活血管内皮,从而产生促动脉粥样硬化粘附分子和细胞因子[20,77]。正如我们之前所展示的,香烟烟雾在内皮细胞和人类单核细胞以及体内诱导NRF2抗氧化防御系统[9,26]。在NRF2自身表达不变的情况下,诱导其靶基因HMOX1和NQO1的表达呈剂量依赖性。在NGP刺激下,人类单核细胞通常表现出较低且向右移动的细胞氧化应激反应激活。最近的研究调查了ngp对各种细胞系统中细胞氧化应激和NRF2系统的影响[67,68]。他们一致发现,与使用NGP和传统吸烟相比,这种抗氧化细胞防御系统的功能减少,而且往往延迟。这与我们在这项研究中的发现是一致的。

活性氧在动脉粥样硬化的进展中起着至关重要的作用。特别是单核细胞中氧化应激的标志物NOX2产生的超氧化物有助于内皮功能障碍和动脉粥样硬化的发展。因此,我们分析了3R4F、e- cige和HTP对人单核细胞NOX2的影响。有趣的是,与3R4F相比,电子烟和HTP刺激在高AqE浓度下显著诱导NOX2 mRNA表达。与其他被研究的标记物相比,NOX2仅受3R4F的轻微调节,但似乎可以被高剂量的NGP诱导。我们的研究在这方面显示了与以往文献相反的结果。在这些研究中,研究表明,在体外和体内,吸烟增加NOX2的表达和NOX2产生超氧化物[36,64]。此外,吸电子烟和传统香烟会导致志愿者体内NOX2水平显著增加,而电子烟的影响较小。

吸烟导致慢性全身性炎症反应[4,52]。几个促炎关键标志物对于单核细胞粘附内皮至关重要,这是血管炎症和动脉粥样硬化病变进展的关键步骤。我们之前的一项体外研究记录了3R4F处理后单核细胞对内皮细胞的粘附增加。这与其他在3R4F刺激后显示类似结果的研究一致[54,56]。其他几项体外和体内研究先前已经证明,吸烟会增加单核细胞对内皮细胞的粘附[18,19,35]。这些功能数据可能与粘附分子和细胞因子等几种炎症标记基因的mRNA表达增强有关。然而,有研究表明,在对传统卷烟和替代烟草制品的反应中,炎症标志物的表达增加[46,59,75]。本研究通过对ICAM1、CCL2、IL1B、IL8和TNF的表达分析,确定了单核细胞的促炎表型。吸烟刺激下ICAM1 mRNA和蛋白表达的诱导与本人前期研究及已有文献一致,认为吸烟通过增强粘附分子表达介导单核细胞粘附增强[1,60]。Poussin等人发现,用3R4F刺激的MM6单核细胞上清液处理后,内皮细胞ICAM1表达升高,这表明人类单核细胞急性暴露于3R4F参考香烟[54]的吸烟提取物后,会出现炎症。CCL2是一种单核细胞特异性表面标志物,可诱导局部炎症并加速动脉粥样硬化,仅在3R4F治疗中,CCL2的mRNA和蛋白水平上调,而在NGP治疗中则不一致。研究表明,无烟烟草[24]提取物增加了人内皮细胞中的CCL2,并且CCL2的激活可能参与了cseaq介导的单核细胞粘附内皮细胞[28]。因此,CCL2似乎是分析不同烟草制品治疗后细胞炎症反应的可靠关键参数。我们的数据表明,与人类单核细胞中的3R4F相比,电子烟和HTP刺激下的炎症表型发作较晚。通过研究人单核细胞中il - 1b、il - 8和TNF的表达,可以证实3R4F具有更高的有害潜能。可以检测到这些标记物的mRNA和蛋白质水平的剂量依赖性增加,而NGP治疗只有轻微的影响。这与Walters等人的研究一致,该研究显示烟雾诱导人单核细胞中IL1B、IL8和TNF的释放[74],并进一步得到Yang等人的研究的支持,该研究揭示了CSEaq刺激诱导MonoMac6单核细胞中IL8和TNF的表达[79]。

在解释和比较烟提取物处理的数据时,需要仔细考虑的一个重要方面是使用的AqE浓度的标准化。在相应的文献中,在体外和体内应用烟提取物时,使用了各种归一化因子,如抽吸次数、百分比或尼古丁含量[23,55,66,76]。为了比较不同吸烟研究的影响,必须说明和考虑详细的产品规格。在目前的研究中,所有类型的AqE都是使用相同的条件和参数(HCI吸烟制度)产生的。百分比匹配的刺激产生相同稀释的不同产品与已知的尼古丁量和最小的变化,这可以相互比较。

下一代烟草和尼古丁产品(NGP)通常被认为是传统吸烟的“更安全的替代品”,这使得它们的实际生物学影响目前备受关注。来自体外、动物和人类临床研究的各种数据已经发表。大多数研究都显示了与传统香烟相关的ngp生物影响的类似结果。这证实了体外方法在模拟体内条件的简化和定义的体外条件下表征测试化合物的分子和功能效应的研究中的相关性。

结论

这项研究表明,在体外用传统香烟刺激人类单核细胞,在低剂量下可导致抗氧化和促炎机制的启动,而用替代吸烟产品治疗可导致所分析的研究参数的激活降低:细胞活力、细胞氧化应激反应和炎症状态。与3R4F相比,接触NGP通常会使反应向右转向更高剂量。因此,该研究方案可被认为是下一代烟草和尼古丁产品评估的有效模型系统。



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