2023-04-27 12:30

从暴露于乙醇中毒的青少年中分离的循环细胞外囊泡的脂质组学景观:一项性别差异研究

摘要

背景

脂质是细胞外囊泡(EVs)的重要组成部分,在EVs的生物发生、释放、靶向和细胞摄取过程中起着结构和调节作用。重要的是,脂质失调与几种疾病有关,包括代谢综合征、炎症和神经功能障碍。我们最近的研究结果表明,血浆EV microrna可能是青少年酒精中毒引起的神经炎症和脑损伤的放大器和生物标志物。考虑到血浆EV脂质作为调节分子和生物标志物的可能作用,我们评估了急性乙醇中毒如何影响男性和女性青少年血浆EV脂质组成的差异,并探讨了免疫反应的参与。

方法

从人、野生型(WT)和toll样受体4缺陷(TLR4-KO)小鼠中提取血浆ev。在提取EV脂质和质谱采集数据后进行预处理和探索性分析。通过比较乙醇中毒和对照组人类雌性和雄性个体,以及乙醇处理和未处理的WT和TLR4-KO雌性和雄性小鼠,分析脂质丰度的差异。将脂质标注为相应的类并进行脂质集富集分析以评估其生物学功能。

结果

我们首次证明,急性乙醇中毒诱导人类青少年女性血浆中不同的EV脂类比男性更高的富集。我们观察到雌性鱼的PA、LPC、不饱和FA和FAHFA脂类含量较高,而雄性鱼的PI含量较高。这些脂类参与EVs的形成、释放和摄取以及免疫反应的激活。此外,我们观察到乙醇处理的WT和TLR4-KO小鼠EV脂质组成的变化(例如,乙醇处理的WT雄性中甘油磷酸肌醇的富集),并且脂肪丰度的性别差异在WT小鼠中比在TLR4-KO小鼠中更为显著。所产生的所有数据和结果已在一个基于网络的平台(http://bioinfo.cipf.es/sal)上公开提供。

结论

我们的研究结果表明,与男性相比,女性青少年酗酒导致与EV生物发生和神经炎症反应传播相关的血浆EV脂质含量更高。此外,我们发现WT小鼠的脂质丰度与TLR4-KO小鼠相比存在更大的性别差异。我们的研究结果也支持将富含ev的脂质作为青春期乙醇诱导的神经炎症的生物标志物的潜在用途。

背景

细胞间通讯是通过细胞间的直接接触和分泌因子(分泌组)[1]的内体胞吐介导的。细胞外囊泡(EVs)是细胞分泌组的重要组成部分,几乎每一种细胞类型都有分泌,并存在于许多体液中。一系列的研究已经证明了含有多种DNA、RNA、脂质和蛋白质的ev在炎症、癌症和神经退行性疾病等生理过程和病理条件中的作用。虽然最近的研究提供了大量关于电动汽车蛋白质和微RNA含量的信息,但我们对脂质知之甚少,尽管它们在电动汽车的生物发生、释放、靶向和细胞摄取过程中起着关键的结构和调节作用。EV通常表现出胆固醇、鞘磷脂和饱和磷脂的富集,表明EV膜含有脂筏样结构域[4,5,6]。组装的分子脂质和膜结合蛋白决定了膜结构域的结构和功能;因此,更好地了解形成EV膜的特定蛋白质和脂质的作用将为控制EV形成、释放和随后功能的机制提供丰富的信息。由于来自不同生物体液的电动汽车的特定含量含有与其起源细胞[6]紧密相关的分子,因此电动汽车可以被认为是各种病理状况[7]的非侵入性诊断生物标志物的来源。

作为影响一系列病理状况(包括代谢综合征、炎症和神经系统疾病)的基本结构和功能分子,脂质在结构和物理化学性质上具有巨大的多样性,这支持了它们参与广泛的生物功能[10]。脂质组学已经成为一门创新的学科,它支持发现具有相关生物医学应用的新型脂质。以质谱为基础的脂质组学与综合计算策略相结合,可以对产生的大量数据进行分析,这是一种强大的分析工具,可以对细胞、组织或体液的脂质组进行鉴定和定量,揭示由病理条件、环境压力源或治疗剂[8]引起的细微扰动。

青春期酒精滥用(酗酒)可导致神经炎症、神经变性和认知功能障碍[9,10]。乙醇暴露激活神经胶质细胞中的toll样受体4 (TLR4),诱导细胞因子和炎症介质的释放,从而导致脑损伤[11,12]。我们之前的研究表明,通过增加富含炎症相关蛋白和TLR4反应相关mirna[13]的ev的释放,ev在乙醇诱导的神经炎症的传播中发挥作用。此外,我们还发现,青少年女性比青少年男性更容易受到乙醇的影响,因为女性在血浆中表达的炎症分子(如细胞因子、趋化因子和EV microrna)水平高于男性[14,15]。

鉴于EV脂质的关键作用,我们采用了一种高度敏感的脂质组学策略来表征从人和小鼠血浆中分离的EV脂质,分析急性乙醇中毒对男性和女性青少年血浆EV脂质含量的影响,并评估血浆EV脂质在激活免疫反应中的不同功能作用。

方法

人类被试

我们的临床样本包括西班牙萨拉曼卡大学医院急诊科收治的18名青少年和年轻人(50%为女性),他们患有中度至重度急性乙醇中毒[14,15,16]。急性乙醇中毒的定义为临床体征和症状(例如,神志不清/定向障碍,运动不协调,步态不稳,推理障碍和言语不清),血液酒精水平(BALs)为100 - 110克/升,并且在入院前6小时内至少饮用5杯(男性50克)或4杯(女性40克)标准饮料。酒精中毒是一种临床上有害的疾病,由摄入大量酒精引起,导致血液中酒精含量高。酒精中毒患者通常定义为BAL大于5.4-17.4 mmol/L (25-80 mg/dL或0.025-0.080%)[18]。值得注意的是,个体通常无法回忆起饮酒总量或第一次和最后一次摄入乙醇之间的时间。排除标准是存在其他急性(例如创伤或感染)或慢性疾病、药物使用或怀疑/确认使用非法药物(大麻除外)。表1描述了本研究中个体的临床、流行病学和分析特征。

表1研究个体急性乙醇中毒的特征

研究还包括从医学和护理专业学生中招募的18名健康对照者(9名男性和9名女性)。对照者除了偶尔少量饮酒外没有饮酒,在抽血前72小时内没有报告饮酒情况,在研究前三个月没有酗酒事件。这些受试者血液学和血浆生化指标正常,未报告任何慢性或急性疾病。本研究按照《赫尔辛基宣言》进行,并经萨拉曼卡大学医院伦理委员会批准(2012年11月22日),每位参与者均获得了书面知情同意。入院时采集患者血液样本用于标准护理和研究目的,并用于测定BAL、全血细胞计数和肝功能评估[血清天冬氨酸转氨酶(IU/L)、丙氨酸转氨酶(IU/L)、碱性磷酸酶(IU/L)和γ-谷氨酰转肽酶(IU/L)水平]。收集的血清在液氮中快速冷冻,并在- 80°C保存待用。只有在患者能够提供知情同意后,本研究才对样本进行处理和分析。图1A总结了人体实验组。

图1
figure 1

脂质组学工作流程,描述每个步骤所分析的受试者和所进行的比较。实验分为人类和小鼠两组。B从人和小鼠血浆中分离EV后,提取脂质,用LC-MS /MS进行定量鉴定。还进行了额外的探索性和差异脂质丰度分析。在脂类注释后,还对人类样本进行了类富集分析。最后,应用功能分析来解释差异丰度分析结果

动物和治疗策略

本研究使用C57/BL6野生型(WT, n = 24)和tlr4敲除型(TLR4-KO, n = 24)小鼠(C57/BL6背景,由Dr. S. Akira, Osaka, Japan提供)。实验共使用48只动物,每组6只。按基因型将3 - 4只动物放入每个笼子中,在温度(23°C)、湿度(60%)和光照/黑暗周期(12小时/12小时)的控制条件下,用水和固体饲料自由饲养。所有实验程序均按照欧洲共同体理事会指令(86/609/ECC)和西班牙皇家法令53/2013批准的指导方针进行。经西班牙皇家法令1386/2018修订,并于2019年6月19日获得Príncipe Felipe研究中心(CIPF, Valencia, Spain)动物实验伦理委员会批准(项目识别码:2019-08)。

为了模拟狂饮酒精,按照Pascual等人(2007)的先前描述,连续两天向30日龄小鼠腹腔注射生理盐水(上午9-10点)或等渗生理盐水中25% (v/v)乙醇(3 g/kg),间隔2天,连续两周(出生后第30天至第43天)。雌性和雄性小鼠的BALs与人类酒精中毒青少年相似或更高,为~ 320 mg / dL(注射后30分钟达到峰值)。最后一次(第8次)乙醇或生理盐水(PND 44)麻醉24 h,取肝门静脉全血。离心后,分离的血浆样品在液氮中快速冷冻,并在- 80°C保存待用。图1A总结了小鼠实验组。

从人和小鼠血浆中分离EV

血浆EVs采用总外泌体分离试剂盒(目录号4484450,美国Invitrogen公司),按照制造商的说明进行分离。取250 μL初始血浆分离ev,收集后-80℃冷冻处理。

透射电镜和纳米颗粒跟踪分析表征电动汽车

新鲜分离的ev用2%多聚甲醛固定,按照前面描述的[13]制备。在透射FEI Tecnai G2 Spirit电子显微镜(FEI Europe, Eindhoven,荷兰)和数码相机Morada (Olympus Soft Image Solutions GmbH, m nster,德国)下检查制备的样品。此外,如前所述,使用NanoSight NS300 Malvern (NanoSight Ltd., Minton Park, UK)分析了电动汽车的绝对尺寸范围和浓度。图2通过电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析报告了电动汽车的特征。

图2
figure 2

血浆ev的表征。人类和小鼠的电子显微镜图像。B通过纳米颗粒跟踪分析测量人体EV大小分布和浓度。在100 ~ 200 nm之间有一个峰值,包括电动汽车的尺寸范围。C分析EV和细胞裂解物中EV标记物(CD9、CD63和CD81)的蛋白表达。钙连蛋白的表达被用来消除EV样品中细胞质蛋白的污染。星形胶质细胞的细胞裂解液作为钙连联素表达的阳性对照。血浆EV样品中检测LDL和HDL污染的ApoB-100和ApoA-1的D表达。血浆EV样品未被LDL和HDL颗粒污染。总血浆作为ApoB-100和ApoA-1表达的阳性对照。每种蛋白的代表性免疫印迹图如图所示

Western blot分析

为了表征目的,在血浆EVs中进行Western blot(图2),使用其他地方描述的方案[10]。所用的一抗为:抗cd9、抗cd63、抗cd81、抗calnexin (Santa Cruz Biotechnology, USA)、抗apob -100和抗apoa -1 (Thermo Fisher Scientific, Illinois, USA)。清洗膜,与相应的酶标二抗孵育,并使用ECL系统(ECL Plus;赛默飞世尔科技公司)。附加文件1:图S1包括每个蛋白表达的全膜。

脂质提取

使用改良的Folch提取程序从等量血浆EVs (0.2 ml/样品)中提取脂质。含有脂质的最后一相被转移到一个新鲜的管中,用氮气干燥真空,储存在- 80°C,直到进一步分析。用异丙醇重悬干燥后的样品,采用不同的LC/MS获取方法(正离子和负离子模式)。

质/ MS分析

在全自动Q-TOF采集模式下,采用迭代MS/MS采集36个样品(4个条件× 9个重复)的人脂质提取物。详细的色谱和autoMS/MS质谱的实验方法按照之前的描述[20,21]进行了修改。简单地说,样品分离使用Agilent 1290 Infinity LC系统耦合到6550 Accurate-Mass QTOF (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA),电喷雾界面(Jet Stream Technology)在正离子(3500 V)或负离子模式(3000 V)和高灵敏度模式下工作。电喷雾界面的最佳条件为气体温度200℃,干燥气体12 L/min,雾化器50 psi,鞘气温度300℃,鞘气流量12 L/min。脂质在Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色谱柱(3.0 × 100 mm, 2.7 μm) (Agilent, Santa Clara, CA, USA)上分离。在优化条件下,溶剂的流动相由0.2毫米(10毫米醋酸铵、氟化铵在水中9:1 /甲醇)和溶剂B(10毫米醋酸铵,0.2毫米的氟化铵2:3:5乙腈/甲醇/异丙醇)使用以下梯度:0分钟70% B, B 1分钟70%,3.50分钟86% B, B 10分钟86%,11分钟100% B, 17分钟100% B操作在50°C和一个常数0.6毫升/分钟的流量。阳性和阴性模式的进样量均为5µL。

数据采集采用Agilent Mass Hunter工作站软件。LC/MS数据采集B.10.1 (Build 10.1.48)在自动MS/MS中操作,选择300-1700 m/z质量范围内(超过5000计数和0.001%的阈值)的三个最强离子(电荷态,1-2)进行MS/MS分析。将四极杆设置为“窄”分辨率(1.3 m/z),获取MS/MS光谱(50-1700 m/z),直到总计数为25,000次或累积时间限制为333 MS。为了确保所记录离子的所需质量精度,在分析过程中使用m/z 121.050873和m/z 922.009798信号为正模式,m/z 119.03632和m/z 980.016375信号为负模式,进行连续的内部校准。此外,在单个样品上获得了全离子MS/MS[22]数据,MS采集速率为3个光谱/秒,扫描段为0、10、20和40 eV。

脂质注释器数据库se

脂质组学工作流程的第一步是使用脂质注释器软件1对汇集的人类细胞提取物的5组5个迭代MS/MS数据文件进行分析。本研究使用一种新颖的软件工具(脂质注释器)[23],结合贝叶斯评分、概率密度算法和非负最小二乘拟合,搜索Kind等人[24,25]开发的理论脂质库(改良的LipidBlast),对MS/MS谱进行注释。

所有其他数据分析均使用Agilent MassHunter脂质注释器1.0版本。除了只考虑[M + H] +和[M + NH4] +前驱体进行正离子模式分析,只考虑[M−H] -和[M + HAc−H] -前驱体进行负离子模式分析外,使用默认方法参数。使用Agilent MassHunter Personal Compound Database and Library (PCDL) Manager Version B.08 SP1来管理和编辑导出的注释。

脂质鉴定

在Agilent Mass Hunter Qualitative version 10.0中,使用所创建的脂类Personal Compound Database和Library (PCDL)数据库对36个全离子MS/MS数据文件进行批量目标特征提取。提供的“测脂仪”。在Mass Hunter定性软件中采用了m”方法,并进行了先前由Sartain等人(2020年)描述的修改。数据分析采用MassHunter定性分析中的FbF (Find by Formula)算法。该方法使用了FbF算法的改进版本,支持全离子质谱/质谱技术。首先将低能通道中的质量峰与具有相同m/z值的化合物的PCDL进行比较,然后自动编制一组假定的鉴定。对于这个列表,将来自PCDL的MS/MS光谱中的片段离子与高能通道中检测到的离子进行比较,以确认正确片段的存在。前体和产物被提取为离子色谱图,并使用共洗脱评分进行评估。该软件计算一个数字,说明丰度,峰形状(对称性),峰宽度,和保留时间。所得化合物在Mass Hunter定性版中进行了综述;不合格的特性被手动删除。定性结果和合格的特征导出为a.cef文件。

生物信息学分析

本研究采用的策略是基于转录组学分析工作流程。所有生物信息学和统计学分析均使用R软件v.3.6.3[26]进行。图1B展示了实验设计。

数据预处理

数据预处理包括过滤实体、丰度脂质矩阵归一化和探索性分析。定性结果(。cef文件)导入Mass Profiler Professional (MPP) (Agilent Technologies)进行统计分析,其中分别创建了正离子和负离子模式的实验。根据频率筛选实体,选择那些在至少一种处理的所有重复中一致出现的实体。采用百分位移位归一化算法(75%),数据集以所有样本的中位数为基线。当存在不同保留时间的重复脂质时,计算其丰度值的中位数。数据归一化后进行探索性分析,使用聚类分析、主成分分析(PCA)以及样品和脂质的盒状图和晶须图,以检测样品和脂质的丰度模式以及数据中的批效应异常行为。此时,排除表现异常的样本和异常值(数据集中低于第一个四分位数(Q1)或高于第三个四分位数(Q3)的值超过1.5 ×四分位数间距(IQR)),以呈现对差异丰度分析具有关键影响的稳健批效应。

差异脂质丰度

采用limma R包[27]比较各组间脂质丰度水平。使用Benjamini和Hochberg (BH)程序调整p值[28],当BH调整的p值≤0.05时,认为存在显著的脂质。

类富集分析

使用RefMet数据库[29]进行类标注,并与脂质地图数据库[30]进行比较。分类是分层的。作为这种划分的第一步,脂类被分为几个主要类别(“超类”),包含不同的主要类和亚类分子,设计了一种标准的方式来表示单个脂类及其衍生物的化学结构。附加文件1:表S1和图5和图6的图例详细说明了所有缩写。注释之后,根据p值和差异脂质丰度统计量的符号对脂质进行排序。与基因集富集分析(GSEA)方法类似,类富集分析使用mdgsa R封装[31]中实现的脂质集富集分析(LSEA)进行。对BH校正p值,BH校正p值≤0.05的分类为显著性。

比较

我们对每组(人类、WT小鼠、TLR4-KO小鼠)进行了三次比较,分析脂质丰度的差异(图1B):(i)雌性的乙醇效应(EEF),比较了乙醇中毒的雌性和对照组的雌性;(ii)雄性的乙醇效应(EEM),比较酒精中毒的雄性和对照雄性;(iii)性乙醇相互作用(SEI),比较EEF和EEM。在人类样本中使用相同的三种比较来评估类富集分析。

用于测量差异模式的统计量为fold change (LFC)的对数,用于量化差异脂质丰度分析的效果,以及比值比(LOR)的对数,用于测量每种功能类的富集程度。正的统计符号表示比较的第一个元素中变量的平均值较高,而负的统计符号表示第二个元素的平均值较高。SEI比较侧重于发现女性和男性比较之间的差异。因此,一个正的统计数据可能表明,在女性受试者中,该变量的上调和男性受试者的下调,或者在醉酒的女性受试者中,该变量的增加或减少更高。另一方面,负统计值可能表明在男性受试者中该变量的上调和女性受试者的下调,或者在男性受试者中该变量的升高或降低较高。在这个比较中,必须对各组中每种脂质的行为进行后验评估,检查女性和男性的比较(附加文件1:图S2)。

此外,在不同的比较中,包括人类和小鼠之间,对差异丰度结果进行了相关性分析。皮尔逊相关系数测量了这些差异轮廓之间的关系,提供了一个整体的画面,而比较之间显著脂质的交集提供了比较结果的特定视图。这些方法的互补性提高了对评估比较结果的理解。

网络平台

在生物信息学分析的不同步骤中产生的所有数据和结果都可以在web平台(http://bioinfo.cipf.es/sal)上获得,任何用户都可以免费访问该平台,并允许对本文中描述的结果进行确认。前端使用Angular框架开发,该web资源中使用的交互图形使用plotly[32]实现,探索性分析聚类图使用ggplot2 R包[33]生成。

这个易于使用的资源分为七个部分:(1)分析结果的总结;(2)探索性分析和(3)每项研究的差异丰度的详细结果;(4)类标注结果;(5) LSEA结果,用户可以通过图形和表格与web平台进行交互,并搜索与脂质种类或类别相关的特定信息;和(6-7),包括方法、生物信息学脚本和附加文件1。


目录

摘要
突出了
通俗易懂的语言总结
背景
方法
结果
讨论
结论
数据和材料的可用性
参考文献
致谢

作者信息
道德声明

补充信息



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结果

Sex-ba从人类酒精中毒青少年分离的血浆EVs脂质谱的差异

醉鼠男女个体的中位年龄分别为18.0岁(四分位间距18.0 ~ 21.0)和19.0岁(四分位间距19.0 ~ 20.0);这些年龄被认为是青春期晚期(16-20岁)或成年早期(21-25岁)[34,35]。中毒期间血浆生化分析显示,女性的中位bal为2.10 g/L (IQR 1.80-2.20),男性为2.40 g/L (IQR 2.25-2.73)。我们在研究对象中没有发现滥用其他药物的证据。总体而言,BAL数据在女性中表现出比男性更广泛的分散。对照组女性的中位年龄为21.5岁(IQR 21.0-22.5),男性为23.0岁(IQR 21.0-23.0)。

我们通过LC-MS /MS使用负离子和正离子模式分析了对照组和乙醇中毒女性和男性血浆ev的脂质组学特征,分别鉴定出381和276种脂质化合物。在对样本数据进行归一化,过滤异常值,并用中位数汇总重复的脂质后,我们得到了330和247个阴性和阳性模式的脂质。

我们使用RefMet和脂质MAPS数据库对人类受试者中鉴定的所有脂质进行分类,以在分子水平上表征乙醇中毒女性和男性青少年之间脂质组成的差异。图3描述了所有人血浆EV样本的脂质谱中超类和主要类的总数(附加文件1:表S2和S3包括子类)。总的来说,EV的脂质组成显示神经酰胺、鞘磷脂、甘油磷脂和三酰甘油富集,但脂肪酸和脂肪酯的比例较低。

图3
figure 3

青少年血浆EVs总脂质的分类:超类(内)和主要类(外)。超级类百分比显示了每个超级类在总脂质中所代表的脂质数量。外部和内部的百分比表示通过负(A)和正(B)离子模式获得的超类和主类总脂质

如材料和方法部分所述,我们采用了三种比较来分析不同组人血浆EVs中脂质丰度的差异(EEF,乙醇对女性的影响;EEM,乙醇对男性的影响;性-乙醇相互作用)。表2描述了那些脂质,在酒精中毒的女性和男性中,与他们各自的对照组相比,显示出显著的丰度变化。乙醇中毒的雌性在差异丰度分析中显示出显著的变化(72种脂质),而乙醇中毒的雄性有33种脂质显著改变。此外,我们在负离子和正离子模式下发现了8种常见的脂质(图4,附加文件1:表S4和表S5)。两个变量(性别和治疗)的相互作用揭示了24个显著的脂质物种,EEF和SEI比较共有17个脂质物种,EEM和SEI比较共有5个脂质物种(图4,附加文件1:表S4和表S5)。

表2两种离子模式下人类显著丰度的脂质总结
图4
figure 4

人类样本差异丰度分析结果的颠覆图。每次比较的结果根据LFC符号分开。水平条表示每个比较中重要的脂质数量(每个比较用特定的颜色表示)。竖条表示包含在组的交叉点中的脂质,下面用彩色圆点表示。条形图下的彩色圆点表示这一组基因的特异性。使用的比较:EEF(女性的乙醇效应),EEM(男性的乙醇效应)和SEI(性-乙醇相互作用)

在差异丰度分析中,所有脂类的LFC值的EEF和EEM比较之间的关系在两种离子模式下都显示为正相关;然而,相关系数仍然接近于零(负离子模式0.22,正离子模式0.30)(附加文件1:图S3),表明变量性别与乙醇中毒之间缺乏任何关系。这些结果为乙醇中毒引起的脂质丰度的性别差异提供了强有力的证据。

Sex-ba功能上的差异乙醇中毒青少年血浆EVs的脂质谱分析

我们将重要的脂质种类划分为功能类,以便更深入地分析血浆ev的脂质集。图5报告了分类的分布,显示了几个主要类别的显著差异:甘油磷酸肌醇、甘油磷酸、甘油磷酸胆碱、脂肪酸和脂肪酯。亚类分析显示,酒精中毒女性青少年血浆ev中PA、LPC、不饱和FA和FAHFA显著富集,而酒精中毒男性只有PI上调;然而,我们观察到在酒精中毒的女性青少年中,亚类胆固醇酯的比例要低得多(图5B)。

图5
figure 5

用正负两种模式分类标注人类显著丰度的脂类摘要。A超类百分比(内)显示每个超类在总有效脂类中所代表的脂类数量。主类百分比(外)显示了每个主类在其相应的超类中所代表的脂质数量。B亚类中重要脂质的数量。柱状图表示子类中重要脂类的数量,颜色对应于主要类。比较使用:EEF(乙醇对女性的影响),EEM(乙醇对男性的影响)和SEI(性-乙醇相互作用)。脂质亚类缩写:Cer_AS,神经酰胺α-羟基脂肪酸-鞘氨醇;Cer_NDS,神经酰胺非羟基脂肪酸-二氢鞘氨酸;Cer_NP,神经酰胺非羟基脂肪酸-植物鞘氨酸;神经酰胺α-羟基脂肪酸-二氢鞘氨酸;Cer_AP,神经酰胺α-羟基脂肪酸-植物鞘氨酸;神经酰胺非羟基脂肪酸-鞘氨醇;己糖神经酰胺/己糖神经酰胺非羟基脂肪酸-鞘氨醇;糖基神经酰胺/己基神经酰胺非羟基脂肪酸-二氢鞘氨酸;SM,鞘磷脂;FA:脂肪酸;FAHFA:羟基脂肪酸的脂肪酸酯;PA:磷脂酸;lyso-phosphatidylcholine LPC的;电脑,磷脂酰胆碱;PC-O, EtherPC;PE、磷脂酰乙醇胺;醚磷脂酰乙醇胺(EtherPE);π,磷脂酰肌醇;DAG甘油二酯;TAG,三酰甘油(TG);胆固醇。酯,胆固醇酯

乙醇中毒雌性和对照雌性血浆EVs中一些主要类的脂质组成显示了神经酰胺的高度富集性质;然而,我们观察到一些相关亚类在乙醇中毒的雄性(如Cer_AS和Cer_N)和雌性(如Cer_ADS和Cer_AP)中下调。相比之下,其他主要类别(例如,二甘油酯和鞘磷脂)在乙醇中毒的女性和男性中,与各自的对照组相比,显示出相似的丰度下调(图5B)。

三个人体比较的LSEA结果显示与脂类呈正相关(图6),其丰度存在显著差异(图5)。此外,我们观察到在SEI比较中脂肪酸主类和脂肪酰基超类显著富集。在EEF中,与EEM(负LOR)相比,这两个类别都具有正的LOR值,这表明乙醇中毒雌性的脂质丰度高于雄性(图6)。我们还观察到乙醇中毒雄性的甘油磷酸乙醇胺和PC主类别以及Cer_NS亚类别的富集程度显著高于对照雄性;然而,我们也观察到,在乙醇中毒的雄性中,Cer_ADS的富集程度显著降低。最后,我们发现乙醇中毒雌性中LPC亚类的富集程度明显高于对照雌性(图6)。

图6
figure 6

通过LSEA富集了人类显著的脂类。点的颜色表示变化的符号和幅度(LOR)。比较使用:EEF(乙醇对女性的影响),EEM(乙醇对男性的影响)和SEI(性-乙醇相互作用)。脂类亚类缩写:Cer_NS,神经酰胺非羟基脂肪酸-鞘氨醇;神经酰胺α-羟基脂肪酸-二氢鞘氨酸;电脑,磷脂酰胆碱;LPC, lyso-phosphatidylcholine

Sex-ba研究了乙醇处理的青春期小鼠血浆EVs脂质谱的差异

接下来,我们评估了乙醇诱导的EV脂质组成改变的潜在性别差异,以及tlr4介导的免疫反应在这些影响中的作用。我们分析了对照组和青春期乙醇处理的WT和TLR4-KO小鼠的脂质种类。脂质组学分析显示326和289种脂质化合物为负、正模式;在数据处理后,我们得到291和264种脂质在负离子和正离子模式下进行进一步的差异分析。

我们使用RefMet和脂质MAPS数据库在分子水平上表征乙醇处理的雌性和雄性青春期小鼠的脂质组成差异。对血浆EVs中所有脂类的定量数据分析显示,青少年小鼠(图7A和B)和人类个体(图3)在阴性和阳性模式下,脂类(超类和主类,附加文件1:表S6和S7包括亚类)的百分比相似。图7C和D显示了人类和小鼠样本中182种阴性和124种阳性的常见脂类。图7A和B表明,小鼠EV脂质组成显示神经酰胺、鞘磷脂、甘油磷脂和三甘油酯富集,脂肪酸和脂肪酯的比例较低;然而,我们观察到人类和小鼠样品在一些主要和亚类上的差异(例如,甘油磷酸甘油只在人类中富集,而甘油磷酸丝氨酸只在小鼠中富集)。

图7
figure 7

WT和TLR4-KO青少年小鼠血浆EVs总脂质的分类:超类(内)和主类(外)。超类百分比表示每个超类在总脂质中所代表的脂质数量。外、内百分比表示通过负(A)和正(B)离子模式获得的超类和主类总脂质。维恩图交叉点表示人类和小鼠样品在负(C)和正(D)离子模式下的常见脂质种类

表3和表4显示,经乙醇处理的雌性和雄性WT小鼠分别有12种和47种脂质发生了显著变化;同时,经乙醇处理的TLR4-KO雌性和雄性小鼠分别有66种和58种脂质发生显著变化。图8显示,经乙醇处理的雌性和雄性小鼠在WT小鼠中共享一种脂质,在TLR4-KO小鼠中共享十种脂质。雌性WT和TLR4-KO小鼠仅显示出一种共同的显著差异脂质(图8);雄性WT和TLR4-KO小鼠共有9种脂质,但有3种脂质模式不同(图8,附加文件1:Table S8-S11)。此外,在两种脂质离子模式下,我们观察到EEF WT和EEM WT(低相关系数)之间的脂质丰度模式不同(附加文件1:图S3);相反,我们发现EEF TLR4-KO和EEM TLR4-KO的脂质谱相似(高且显著的相关系数)。我们还观察到,在脂质(负离子模式)中,人类女性和WT女性(EEF, EEF WT)之间存在显著的正相关(附加文件1:图S3)。

表3在两种离子模式下,WT小鼠体内具有显著丰度的脂质总结
表4 TLR4-KO小鼠两种离子模式下显著丰度脂质总结
图8
figure 8

WT和TLR4-KO小鼠样本差异丰度分析结果的翻转图。每次比较的结果根据LFC符号分开。水平条表示每个比较中重要的脂质数量(每个比较用特定的颜色表示)。竖条表示包含在组的交叉点中的脂质,下面用彩色圆点表示。条形图下的彩色圆点表示这一组基因的特异性。WT和TLR4-KO小鼠的比较:EEF(雌性乙醇效应)、EEM(雄性乙醇效应)和SEI(性-乙醇相互作用)

Sex-ba功能上的差异乙醇处理的青春期小鼠血浆EVs的nal脂质谱分析

图9显示,在乙醇处理的雌性WT小鼠中,大多数主要类脂(如甘油乙醇胺和其他甘油脂)均下调,但神经酰胺、鞘糖脂和鞘磷脂上调。有趣的是,我们观察到乙醇处理的WT雄性中二甘油酯的下调和甘油磷酸肌醇和鞘磷脂的上调。在研究从TLR4-KO小鼠分离的血浆EVs主要类脂质的变化时,我们观察到乙醇处理的雌性TLR4-KO小鼠的脂肪酯和脂肪酸主要类以及乙醇处理的雄性TLR4-KO小鼠的其他甘油脂质的差异(图10)。在TLR4-KO小鼠中仅具有显著意义的脂肪酰基超类和在WT动物中仅具有显著意义的脂质超类是乙醇处理WT与TLR4-KO小鼠的主要差异(图9A, 10A)。在主类水平上,我们观察到TLR4-KO和WT小鼠有几个显著差异;然而,结果在丰度方面有所不同(图9B、10B)。其他主要甘油类在经乙醇处理的雌性WT和经乙醇处理的雄性TLR4-KO中下调。相比之下,我们在对照组和乙醇处理的WT雄性小鼠中分别只观察到二甘油酯和甘油磷酸肌醇的主要类别。当我们比较人类和WT小鼠时,只有甘油磷酸肌醇主要类别显示出共同的模式(图5和9)。

图9
figure 9

WT小鼠中不同类注释的显著丰度脂类综述。A超类百分比(内)显示每个超类在总有效脂类中所代表的脂类数量。主类百分比(外)显示了每个主类在其相应的超类中所代表的脂质数量。B主要类别中重要脂类的数量。柱状图显示了主要类别中重要脂质的数量。用于WT小鼠的比较:EEF(雌性乙醇效应),EEM(雄性乙醇效应)和SEI(性-乙醇相互作用)

图10
figure 10

TLR4-KO小鼠中不同类注释的显著丰度脂类综述。A超类百分比(内)显示每个超类在总有效脂类中所代表的脂类数量。主类百分比(外)显示了每个主类在其相应的超类中所代表的脂质数量。B主要类中重要脂质的数量。柱状图显示了主要类别中重要脂质的数量。TLR4-KO小鼠的比较:EEF(雌性乙醇效应)、EEM(雄性乙醇效应)和SEI(性-乙醇相互作用)

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web平台(http://bioinfo.cipf.es/sal)包含有关本研究中涉及的互补计算方法的详细信息。该资源包括对每种生物进行的每种分析的统计指标,用户可以探索这些指标以确定他们感兴趣的概况。这个开放资源希望有助于研究人员之间的数据共享,阐述创新研究,并发现新的发现。



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