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2023-04-23 15:33

酒精对UV-C辐射的细胞保护作用及其与γ辐射的比较研究

摘要

采用单线态氧传感器绿色化学探针监测单线态产氧量;化学探针与单线态氧反应产生荧光内过氧化物。在辐照体系中加入乙醇导致荧光信号减弱,这表明UV-C辐照下形成的单重态氧浓度降低。因此,在研究中的系统中,乙醇很可能淬灭单线态氧。使用甲醇时不会发生这种淬火。当在乙醇和孟加拉玫瑰的存在下照射大肠杆菌细胞以获得更高的单线态氧产量时,与没有孟加拉玫瑰的系统相比,细胞的辐射敏感性降低得更大。乙醇浓度越高,对细胞的保护作用越强;因此,乙醇很可能可以清除单线态氧,并提供部分保护,使细菌免受UV-C辐射的影响。这些结果与先前发表的数据进行了比较,在这些数据中,细菌在酒精存在的情况下受到伽马辐射照射。

介绍

人们早就知道,由于水的辐射溶解,辐射与细胞的相互作用会产生活性氧(ROS)[1],它与细胞结构发生反应,导致细胞损伤,并最终导致细胞死亡。关键结构主要是构成细胞膜的DNA、蛋白质和磷脂。电离辐射的这种间接效应被广泛应用于医疗保健中,如癌症的治疗、消毒、保持卫生、医院仪器的灭菌等。与直接效应(电离辐射与细胞器分子的直接反应)相比,电离辐射的间接效应对细胞损伤的影响更大,因为电离辐射与水的相互作用比与DNA分子的直接相互作用的可能性更大[2,3]。在间接影响中,最大的损害是由羟基自由基造成的。为了减少这些破坏性影响,OH自由基清除剂被用来阻止自由基与细胞结构发生反应,从而降低其对给定辐射的敏感性。例如,这些物质包括简单醇、甲酸钾、二甲基亚砜(DMSO)、抗坏血酸等。已经发现单质醇可以降低细菌和微生物的辐射敏感性,并有助于保护细胞免受辐射的影响。此外,辐射敏感性还受辐射剂量和剂量率的影响[5,6]。与电离辐射不同,紫外线辐射主要被嘌呤和嘧啶基吸收。这种吸收导致嘧啶二聚体的形成(其中T-T, C-C或T-C碱基并排在同一条链上),这会破坏给定DNA位点的结合,从而阻止其经历标准的复制过程[7,8]。

ROS还包括单线态氧1O2(一种具有自旋多重性的氧的激发形式1)。其特性被用于光动力疗法(PDT)治疗各种形式的癌症[9,10]。光动力疗法是一种非侵入性治疗各种形式癌症的方法,最常见的是皮肤黑色素瘤、肺癌、脑癌、口腔癌、胃癌、肠癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌和宫颈癌,但也可用于退行性视网膜疾病、冠状动脉疾病或慢性牙周炎。它是基于光敏放射性药物的应用,如卟啉衍生物,这些药物在癌症中积累,当用适当波长的光照射时,经历光化学和光生物过程,导致癌症组织的破坏。破坏主要是由氧引起的,它在生物系统中起着毒性作用。

氧的基态是三重态。从三重态氧到单线态氧的转变是一个被禁止的过程;因此,过渡是通过光敏剂的间接激发发生的。光敏剂是一种光稳定的物质,具有合适的吸收光谱,如果可能的话,还具有荧光以检测其在生物体中的分布。它通常是一种有机染料、芳香族杂环有机化合物或有色过渡金属化合物。单重态氧退激回基态是通过磷光、物理或化学猝灭[12]发生的。在单线态氧的物理猝灭过程中,猝灭分子的能量被转移,然后分散到周围环境中。在化学淬火中,单线态氧与淬灭剂反应产生不同于输入反应物[13]的新氧化产物。

单线态氧检测可以直接或间接进行。在直接法的情况下,检测是实时进行的,通常是通过红外范围内的荧光测量。该方法的缺点是技术复杂,荧光强度低。间接法依靠单线态氧与合适的靶标发生化学反应。间接(化学)方法的主要优点是所使用的吸收或发光探针的灵敏度高,与其他活性氧相比,对1O2的选择性提高。商用探针还具有可用性和易于检测单线态氧[14]反应产物的优点。探针可以是光谱探针,如9,10-蒽二基-二(亚甲基)二丙二酸ABDMA[15]或9,10-二苯基二丙二酸DPA[16],荧光探针,如SOSG(单线态氧传感器绿色)[17,18],化学发光探针,如2-甲基-6-苯基-3,7-二氢咪唑(1,2-α)吡嗪-3- 1 CLA[19]等。

鉴于我们之前关于简单醇作为细胞免受电离辐射影响的保护剂的知识,本文的目的是监测甲醇和乙醇等醇是否可以淬灭单线态氧,以及它们是否参与保护细胞免受UV-C辐射的影响。

实验

醇的猝灭能力

通过光致发光测试来评价醇类化合物的猝灭能力。甲醇或乙醇生理溶液样品(PENTA, Prague, Czechia),分析级纯度(浓度0;1;将1.5和2 mol L−1)、1 × 10 - 6 mol L−1光敏剂Rose Bengal (RB)和1.6 × 10 - 6 mol L−1单线态氧传感器Green (SOSG)分别用UV-C辐射(Philips TUV低压汞灯,11 W, 254 nm)照射0、10、30和50 min。单线态氧与甲醇、乙醇和探针SOSG的反应速率常数见表1。随后使用FluoroMax Plus荧光光谱仪(Horiba Jobin Yvon,日本京都)测量所得内过氧化物(SOSG-EN)的光致发光发射光谱,该荧光仪配备了150 w无臭氧氙气弧光灯,两台切尔尼-特纳单色器和光电倍增管探测器;样品在塑料比色皿中测量。SOSG探针的激发波长为485 nm,发射波长在510 ~ 800 nm之间,最大发射波长为526 nm。首先对只含有探针SOSG和RB的样品进行照射,照射时间为选定的照射时间(0,10,30和50分钟)。随后,测定了含SOSG、RB和酒精的样品。所得到的数据显示了在醇的存在下(当我们认为SOSG和RB信号为100%时)信号(内过氧化物发射光谱的最大值)是如何变化的。误差条是给定酒精浓度的平均值的标准差。标准差按公式(1)计算:

式中N为测量次数,x为实测值(SOSG-EN信号强度的百分比),为实测值的平均值。因此,可以注意到,对于不含酒精(0.0 mol/L)的样品,偏差为零。

表1 Rate co单线态氧与甲醇、乙醇和探针SOSG反应的瞬间

细胞的辐射敏感性

以大肠杆菌(DBM 3125, ICT Prague, Czechia)为原核微生物进行研究。将以标准方式培养的细胞转移到含有不同浓度清除率的等渗溶液中,使细胞浓度在每毫升106 ~ 107个细胞之间变化。乙醇被用作防止辐射影响的保护剂。其浓度范围为0.5 ~ 2.0 mol L−1。用紫外- c光源在聚丙烯管中照射细胞水悬浮液。在紫外照射过程中,对悬浮液进行剧烈搅拌。在这些条件下,可以确定Gy h−1的标称剂量率(就W m−2的流畅率而言,发现了以下近似传递关系:1 Gy min−1对应于0.255 W m−2)。紫外- c辐射的剂量率用碘化物-碘酸辐射计测量,范围为0 ~ 170 Gy h−1,剂量保持在1 Gy不变。照射后,立即将悬浮液适当稀释(采用十进制稀释法),并将0.1 mL悬浮液镀在完整的营养琼脂上(平板计数琼脂PCA, m091, Himedia, Mumbai, India)。同样的程序应用于未辐照样品作为对照。细菌在37℃培养1-2天后,每皿可形成200 - 500个菌落。每个培养独立重复三次,然后取算术平均值。此外,为了提高结果的统计可信度,总是准备两个完整的独立样本,不含清除剂。未辐照样品中含有不同量的清道夫,作为清道夫毒性的对照。

用公式σ = ln S0/ln SS定义的σ量来描述保护,其中S0和SS分别是没有保护和有保护的存活细胞的分数。σ值与清除剂浓度或清除效率的线性关系的斜率kc或kQ分别表示细胞的特异性保护作用。即kc值表示保护作用对清除率浓度变化的敏感性,kQ值表示保护作用对清除率变化的敏感性。清除效率Q用于比较不同的辐射(γ和UV)。Q是乙醇与给定自由基反应的速率常数与其浓度的乘积。


目录


摘要
介绍
实验
结果与讨论
结论
参考文献
致谢

作者信息
道德声明




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结果与讨论

用孟加拉玫瑰作为光敏剂产生单线态氧。图1显示了水系统的发射光谱,其中只有SOSG探针存在,然后是探针和光敏剂的组合。观察到SOSG与单线态氧反应产生的SOSG-内过氧化物(SOSG- en)在526 nm处的发光信号随辐照时间的延长而增加。sosg -内过氧化物信号强度随曝光时间的增加,证实了在辐照系统中产生单线态氧。此外,随着曝光时间的增加,SOSG本身的信号强度也在增加。这是因为SOSG本身就是光敏剂。因此,在每次实验中,有必要对SOSG本身进行照射,并监测其信号强度随照射时间的增加。

图1
figure 1

不同UV-C照射时间下,激发波长485 nm,未加和加玫瑰花样品sosg -过氧化物(SOSG-EN)发射光谱;插图:不含和含孟加拉玫瑰样品的SOSG-EN在最大波长下的信号强度与曝光时间的关系

对大肠杆菌进行了光敏剂(RB)浓度的选择。要求RB的毒性最小,这样结果才不会被这个事实扭曲(图2)。从图中可以看出,浓度1 × 10-4和1 × 10-5 mol L−1对细胞的毒性很大,因此不希望使用它们进行实验。因此,进一步的实验选择光敏剂浓度为1 × 10-6 mol L−1。

图2
figure 2

不同浓度孟加拉玫瑰对大肠杆菌的毒力

如果在辐照前向系统中加入乙醇,sosg -过氧化物(SOSG-EN)的信号会降低。图3显示了与不含乙醇的系统相比,含有乙醇的系统中信号的减少。在辐照时间为0 min时,信号强度的增加可能是由于溶液极性的改变或体系中络合物的形成等过程引起的。

图3
figure 3

SOSG-EN在乙醇体系中不同暴露时间的相对信号强度(2次重复平均值)

有趣的是,如果系统中含有甲醇而不是乙醇(图4),信号不会减弱。不太可能发生化学或物理淬火。这两种醇的不同行为表明,改性剂的性质显著影响其与各种形式的活性氧反应的能力。这些知识可以解释之前关于这些简单醇的不同行为的结果。然而,这种保护作用很大程度上取决于实验条件和许多其他因素,因为这是一个非常复杂和未经探索的过程。在以前的工作中,我们没有进一步分析导致这种效果的原因。在这项工作中,我们重点研究了紫外线辐射对细胞造成辐射损伤的可能原因之一-单线态氧的影响。结果表明,与甲醇不同,乙醇可以作为抗单线态氧影响的保护剂。为了进一步澄清这些事实,有必要进行进一步的系统研究。

图4
figure 4

系统中甲醇淬火探头信号的百分比(4次重复的平均值)

这一知识随后被用于细胞实验,以确定是否有可能通过使用醇等简单物质来保护细胞免受单线态氧的影响。在图5中,当我们在含或不含玫瑰红的生理溶液中用UV-C辐射(名义剂量率为169 Gy h−1,剂量为1 Gy)照射细胞时,细胞的保护作用随着乙醇浓度的增加而增加。因此,无光敏剂和有光敏剂的系统的比保护kc为正,分别为0.17和1.77 L mol−1。这种实验总是至少重复三次。

图5
figure 5

加或不加玫瑰红时,对UV-C辐射下大肠杆菌的保护σ与乙醇浓度的关系

从特异性辐射防护对辐射剂量率的依赖性(图6)可以看出,在0-170 Gy h−1剂量率范围内,与不含RB的情况相比,在孟加拉玫瑰存在的情况下,细胞对UV-C辐射的特异性保护更高。有孟加拉玫瑰的系统的回归斜率(y = 2x + 4.33)比没有孟加拉玫瑰的系统(y = 0.13x)大两倍。这种依赖性表明,剂量率越高,保护σ对清道夫效率变化的敏感性越大。由此可以推断,随着单线态氧和羟基自由基密度的增加(随剂量率的增加),两种辐射下的kQ值均增加(图6A、B)。从kQ值(图6A、B)可以明显看出,乙醇与单线态氧的反应速率对保护效应的敏感性比与OH自由基的反应速率高6倍。kQ值是保护σ和清除效率Q的斜率,其中为乙醇与单线态氧在紫外线辐射下的反应速率常数(图6A)和乙醇与羟基自由基在伽马辐射下的反应速率常数(图6B)。

图6
figure 6

与γ辐射[20](B)相比,有和没有光敏剂玫瑰孟加拉(RB)的UV-C辐射(A)对大肠杆菌和乙醇清除剂的特异性保护kQ与剂量率D*的关系

保护过程是一个复杂的过程。因此,显然,通常不能期望定量表达的保护与特定反应的速率常数之间存在简单的关系[5,6]。醇可以与体系中存在的其他各种底物发生反应。此外,单重态氧可以被其他还原剂清除,而不是酒精。另一个对所产生的保护作用有不可忽视影响的因素是酒精的保护作用及其毒性作用的叠加。这也可以反映在两种醇的最终效果不同上。在进一步的研究中,将适当的重点放在我们系统中的单线态氧产率上,因为否则这个测定是指示性的。

结论

与伽马辐射相比,酒精对紫外线(254 nm)辐射的影响略有保护作用。与甲醇不同,乙醇会熄灭荧光探针发出的信号,因此似乎会与系统中的单线态氧发生反应。当使用孟加拉玫瑰光敏剂时,EtOH在系统中的辐射特异性保护更大。

对所观察到的kQ清除OH自由基和单线态氧的差异的可能解释是,根据上述反应的速率,单线态氧的保护程度大于OH自由基。



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